[发明专利]一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂的制备方法。 

背景技术

大熊猫被誉为中国的“国宝”，是世界级珍稀野生动物，然而它却濒临灭绝，除了人为原因对大熊猫栖息地的破坏以外，疾病死亡成为当前大熊猫种群濒危的关键原因之一。在大熊猫所患的40多种疾病中，犬瘟热是威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病。疫苗免疫目前是预防控制CDV的主要措施，但当前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低与安全性差两大难题。因此，在安全剂量疫苗接种下提高大熊猫机体的免疫力，成为当今疫苗开发研究的焦点。细胞因子是由免疫效应细胞和其他相关细胞产生，具有多种生物学活性，在免疫应答的产生和调节中具有重要作用。 

白细胞介素2(IL-2)是白细胞介素家族中的重要成员，其被作为免疫佐剂增强疫苗免疫效果的报道屡见不鲜。 

IL-2是T细胞生长因子，它最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从GO期进入S期)和分化。T细胞受多种刺激后能分泌IL-2，IL-2又作用于T细胞自身，诱导自身增殖、分化和发挥功能，这种作用称为“自分泌作用”。IL-2能增强T细胞的杀伤活性，在体外与IL-4、IL-5和IL-6一起共同诱导细胞毒性T细胞(TC)的产生，并使其活性大大增强，延长其生长期；在体内IL-2也能增强抗原诱导的TC活性，甚至可以辅助抗原和半抗原直接在裸鼠体内诱导产生TC。由IL-2诱导产生的TC输入体内后可产生明显抗肿瘤作用。 

IL-2能诱导自然杀伤细胞(NK细胞)增殖，增强NK细胞的活性，诱导淋巴因子 激活的杀伤细胞(LAK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)，并刺激它们产生细胞因子。NK细胞表面有IL-2R链，IL-2刺激NK细胞活化和增殖，并能促进NK细胞分泌IFN-γ，增加其表达IL-2R亚基等。高浓度的IL-2在体外还能诱导NK细胞来源、T细胞来源的LAK细胞增殖并促进其活性。 

IL-2对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用。能促使B细胞表达高亲和力的IL-2R，其中α链由B细胞促分裂原诱导表达，而β链由IL-4或IL-6诱导表达。IL-2除了支持B细胞生长外，还能促进免疫球蛋白(IgM/IgG)的分泌，诱导J链合成从而加速IgM向着分泌IgG2转换。IL-2能增强激活(感染、自身免疫病、肿瘤等)B细胞以及白血病细胞所产生的IL-2受体(IL-2R)的表达，并刺激其增殖和免疫球蛋白的生成：此外，IL-2还能刺激少突状神经胶质细胞产生髓碱性蛋白，对该种细胞的增殖则呈双向性调节。 

在人和动物的细胞因子中，IL-2是最先搞清楚分子结构、受体组成和生物学功能的细胞因子，IL-2研究一直居于细胞因子的最前沿，其应用也是研究得最广泛的。在动物医学上，重组IL-2已在一些动物疾病的免疫预防、免疫治疗和构建新一代基因工程苗等方面显示出广阔的应用前景。 

IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。是第一个为美国食品药物管理局(FDA)认可用于治疗癌症的细胞因子药物。张光勤用IL-2结合抗生素等药物治疗山羊痘病与链球菌混合感染，结果表明重组白细胞介素2是治疗山羊痘与链球菌混合感染的有效药物，可显著提高山羊痘与链球菌混合感染的治愈率，并缩短其疗程。秦翠丽等通过用白细胞介素-2对40例大肠杆菌病兔的治疗试验，治愈38只，死亡2只，治愈率为95％，表明白细胞介素-2对兔大肠杆菌病有显著疗效。李祥瑞将重组IL-2用于猪链球菌病的治疗，取得了很好的效果。在寄生虫方面，Lillehoj等报道，在E.imeriatenella或E.acervulina感染鸡的前一天或感染后的第一天，用ConA活化鸡淋巴细胞产生的细胞因子处理鸡，可以明显降低球虫感染鸡卵囊的排出量。 

发明内容

本发明旨在提供一种效果显著且又提取简便，且能直接应用于生产及临床应用的重组大熊猫IL-2(gpIL-2)免疫佐剂，提高犬瘟热疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。 

本发明的技术方案如下： 

一种重组大熊猫IL-2免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤： 

A1、大熊猫IL-2全基因克隆； 

A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；