[发明专利]一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因及其抗重金属应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因的序列，利用农杆菌将该基因转化到植物中，使植物抗金属能力得到提高。

背景技术

随着现代工农业的迅速发展、城市的急剧扩大，自然环境中的重金属污染日益严重。每年因重金属污染带来的粮食减产达1000多万吨，被重金属污染的粮食每年达1200万吨，年经济损失在200亿以上。传统的土壤重金属污染修复技术有排土填埋法、稀释法、淋洗法、物理分离法和化学法等因成本高、效率低，而且会破坏土壤结构，导致二次污染等原因，难以大面积应用。

与传统的处理方式相比，植物修复的主要优点是成本低，处理设施简单，适合大规模的应用，利于土壤生态系统的保持，对环境扰动小，具有美学价值等特点。植物修复是生物修复(bioremediation)的一种方式，又称绿色修复(green remediation)，是以植物忍耐、分解或超量积累某种或某些化学元素的生理功能为基础，利用植物及其共存微生物体系来吸收、降解、挥发和富集环境中污染物的一项环境污染治理技术。

然而，植物修复的关键核心问题在于修复的效率问题，本发明通过基因工程技术提高植物修复的效率，从而希望能引领植物修复技术的新一轮发展。

本项发明利用PTDS法合成了来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因，将该基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的耐重金属能力，该基因对于培育植物抗重金属的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于将一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物的抗重金属的功能。

一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白MaHMBP，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

所述来源于扭脱甲基杆菌的根据植物偏爱人工合成的重金属结合蛋白MaHMBP长234bp，编码的氨基酸73个。

所述来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白MaHMBP通过农杆菌介导转入拟南芥，应用于植物抗重金属性。

所述来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白MaHMBP基因采用人工方法合成，具体包括以下步骤：

1)MaHMBP的人工合成

依照PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因进行化学合成，在保持MaHMBP基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成了MaHMBP基因。

2)MaHMBP农杆菌双元载体的构建

MaHMBP基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在pCAMBIA-1301载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元，这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355启动子+TMV omega leader sequence控制

3)电击法转化农杆菌

参照MicroPulser^TM Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide(BIO-RAD公司)制备农杆菌GV3101感受态.并且将构建好的农杆菌双元载体经电击法转入到农杆菌中。

4)农杆菌介导转化拟南芥

利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内.首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3～5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22℃培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱贮存待用。

5)拟南芥转化植株种子的筛选

将得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测得到转入MaHMBP基因的拟南芥。

6)转基因拟南芥抗重金属性验证