[发明专利]一种纳米固定化纤维素酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工领域，特别涉及一种纳米固定化纤维素酶的制备方法。

背景技术

国际原油价格的不断攀升和全球污染问题的日益加重，世界各国都在不遗余力地研发新能源，而生物乙醇是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。

由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低1～2个数量级，从而造成酶的作用效率较低。另外由于天然纤维素酶多为一次性直接使用，使用成本高，阻碍了该转化过程的工业化。这是限制纤维素酶商业化大规模生产纤维素乙醇的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。

尽管目前现有的技术可以制备纤维素乙醇，但在生产过程中使用的酶尤其是纤维素酶不能回收、不能重复使用、酶成本太高，导致无法进行规模化生产。

目前针对这一问题的解决方案是，通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造；或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源。但不论如何改进工艺、优选菌株，都不能无限制的提高酶活力。另外，自由酶本身存在局限性，如稳定性差、不易储存、不能回收反复使用等。因此，从纤维素酶本身入手解决纤维素乙醇生产时酶成本过高的瓶颈的方案已经收到限制。

采用纤维素酶的固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解决该酶生产应用的实际问题。固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：首先，酶与产物易于分开，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和稳定性；第三，可以多次反复使用和连续操作，降低生产成本；第四，酶不混入产物，可以精简分离工序等。固定化纤维素酶的以上优点使得纤维素乙醇生产过程中酶成本显著降低，有望实现纤维素乙醇商业化生产。

目前应用的固定化纤维素酶方法，存在以下问题：使用表面活性剂：戊二醛、氨水、醋酸、聚乙烯醇、span80等；需要低温冷冻、或者高温；且需要反复冻融；酶活性保留率低，约在40%左右；这些不足，导致制备固定化纤维素酶时，制备过程复杂、环境不友好、不能工业化生产。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种纳米固定化纤维素酶的制备方法，通过控制制备方法中的参数，使制得的纳米固定化纤维素酶相对自由酶活性在85%以上，且所述方法制备的纳米固定化纤维素酶可多次回收使用且酶活性几乎保持不变。

本发明所述纳米固定化纤维素酶的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：搅拌下向正硅酸乙酯加入HCl溶液，经过水解得到透明溶液；

步骤2：将水解得到的透明溶液冷却，回收乙醇，控制透明溶液乙醇的体积百分含量＜1%；

步骤3：在搅拌下向透明溶液加入葡萄糖溶液，再加入纤维素酶柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，最后加入碱性溶液调节pH值为中性，转入4-10℃成胶；

步骤4：将成胶得到的湿胶研磨，水洗除去葡萄糖，将水洗后的混合液进行抽滤得到白色的凝胶，将凝胶进行干燥，研磨，过筛备用。

本发明所述纳米纤维素酶的制备过程为：

首先在常温下以盐酸为催化剂将正硅酸乙酯水解，水解完毕之后得到无色透明的溶胶，采用抽真空的方式回收水解过程中产生的副产物乙醇，然后在搅拌下依次加入模版葡萄糖溶液、纤维素酶缓冲溶液，最后加入氢氧化钠溶液调节体系的pH值到中性，放置生成凝胶，当凝胶化完成之后，把凝胶研磨粉碎，再用水进行洗涤以除去凝胶体系中的葡萄糖模版，最终得到固定化有纤维素酶的纳米介孔材料。

反应原理如下：

正硅酸乙酯在酸或碱催化下的水解反应方程式为：

5Si(OC₂H₅)₄+12H₂O→5SiO₂+12C₂H₅OH