[发明专利]利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，具体涉及利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法。 

背景技术

血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，其最有效的治疗方法是直接注射凝血因子进行治疗。现在最常见的治疗用凝血因子为第八、九凝血因子，然而，经过频繁的外源性凝血因子八、九的治疗后，病人体内产生了对这些凝血因子的抗性，或产生了中和性的抗体，从而增加对凝血因子治疗的风险，导致病人的关节变形，肌肉萎缩，假瘤和过早死亡。 

第七凝血因子rhF Ⅶ是治疗因第八，第九凝血因子rhFⅧ、rhFⅨ产生抗性的遗传性血友病患者的首选替代药物。它也可广泛用于治疗创伤性出血，如车祸创伤、手术性出血、颅内出血，如脑溢血等常见的血液疾病，其临床研究显示出强大的潜力。目前市场上的第七凝血因子的重组蛋白产品使用仓鼠幼体肾脏细胞（CHO）的培养系统进行蛋白表达， 蛋白表达水平低，导致生产成本极高。有鉴于此，有必要提供一种高效制备重组人第七凝血因子的方法。 

发明内容

　针对上述问题，本发明提供了利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其具有较高的蛋白表达水平，进而降低生产成本。 

　其技术方案是这样的，利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的染色体基因中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子；其包括以下步骤：⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA（rhFⅦ cDNA）插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体（pBC1- rhFⅦ），所述表达载体包括调控元件；⑵将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；⑶获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。 

　其进一步特征在于： 

     所述表达载体为pBC1质粒载体；

     所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子，山羊β-酪蛋白启动子，TATA盒，β-酪蛋白外显子1，β-酪蛋白内含子1，β-酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7，8，9,β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段；

      所述重组人第七凝血因子的cDNA 在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBC1质粒载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于β-酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间；

      其更进一步特征在于：

      将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和rhFⅦ cDNA；

      步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔；

      步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔；

所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA；

所述外接信号基因为β-酪蛋白信号肽和hFⅦ原有的分泌信号肽；

      所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期；

所述泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。