[发明专利]靶向性重组PF4及其表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制肿瘤生长的重组肽，将PF4^47-70与环状RGD肽连接构成靶向性重组PF4，并构建其表达系统，属于抗癌基因药物及其技术领域。 

背景技术

血小板因子四是一种具有多种生物学功能的趋化因子，它能够通过抑制内皮细胞的增殖与迁移抑制血管生成，且其47-70肽段抑制活性最强。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽,能够与肿瘤细胞表面高表达的整合素αvβ3结合，因此可作为肿瘤靶向肽进行肿瘤的诊断与治疗，且含有2个二硫键的环形RGD肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制效力最强。而肿瘤的生长与转移依赖于血管的新生，因此抑制肿瘤血管生成已成为一种肿瘤治疗的策略。本发明就是将血小板因子四（PF4）47-70肽段和环状RGD肽巧妙的结合，构建成靶向性重组PF4。它能保证在抑制血管生成的作用下，增加靶向性，降低副作用，从而更有针对性的抗癌。 

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向性重组PF4。 

本发明的第二个目的是提供一种靶向性重组PF4的基因序列。 

本发明的第三个目的是提供一种靶向性重组PF4的DNA表达载体。 

本发明的第四个目的是提供一种靶向性重组PF4的表达系统。 

本发明的技术方案概述如下： 

一种靶向性重组PF4，它同时包含PF4^47-70肽段和环状RGD肽的氨基酸序列；PF4^47-70肽段氨基酸序列为：NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES；环状RGD肽氨基酸序列：ACDCRGDCFCG；具体结构为NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES nX ACDCRGDCFCG或ACDCRGDCFCG nX NGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES；其中nX为连接肽，X是20种人体氨基酸中的一种或多种，n的个数为0至200。 

本发明的靶向性重组PF4基因序列，其设计过程包括以下步骤： 

1）确定靶向性重组PF4各部分肽段的基因序列：根据NCBI数据库中编号为NM_002619.3的PF4基因序列，选取PF4信号肽基因及PF4^47-70基因；根据PDB数据库中编号为1FUV_A的环状RGD肽氨基酸序列，确立其基因序列；确立连接肽氨基酸序列及其基因序列。 

2）拼接、优化获得靶向性重组PF4基因序列：拼接各部分肽段基因序列，并进行密码子优化，优化的得到的基因序列能够编码权利要求1的靶向性重组PF4。 

本发明的靶向性重组PF4的DNA表达载体，是通过将靶向性重组PF4基因序列插入商业化DNA表达载体的合适区域而构建成的，以实现靶向性重组PF4基因的有效表达。 

本发明的靶向性重组PF4的表达系统，是通过将靶向性重组PF4的DNA表达载体导入细胞内而构建成的。 

检测靶向性重组PF4及其表达载体的生物学活性。分别对靶向性重组PF4的体外抑制血管生成活性和靶向性重组PF4的表达载体的体内抑瘤活性进了检测，均达到满意效果。本发明的一种靶向性重组PF4在体外能够抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖，抑制率为50.8%；其真核表达质粒在荷瘤裸鼠瘤体内能够抑制肿瘤生长，最大抑制率达80.73%。 

附图说明

图1真核表达质粒pcDNA3.1(+)-PF4⁴⁷-⁷⁰-RGD构建图 

合成靶向性重组PF4基因序列，用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，然后用T4连接酶连接入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建出真核表达载体pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD。 

图2pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD质粒HindⅢ、XbaⅠ双酶切产物电泳图 

泳道1:DM50005000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp泳道2：pcDNA3.1(+)-PF4^47-70-RGD质粒 

泳道3：pcDNA3.1(+)质粒 

泳道4：MakerⅠ600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp 

泳道5：经HindⅢ、XbaⅠ双酶切过的质粒pcDNA3.1(+)