[发明专利]重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域和环境毒理学领域，尤其涉及一种重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量和活性的检测方法。

背景技术

目前，环境中重金属污染已经成为一个全球性的问题。环境中的重金属通过食物链效应在生物体内富集并持久存在，日益威胁生态环境和人类健康。利用微生物处理工业废水中的重金属，具有费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的关注。近年来，白腐真菌以其对各种异生物质有广泛而独特的降解能力，以及对废水中重金属离子良好的吸附效果而得到广泛研究，其中，尤以对其模式菌种黄孢原毛平革菌的研究居多。

在处理过程中，污染物对黄孢原毛平革菌也有着一定的毒害作用。这些毒性污染物对黄孢原毛平革菌的生长、繁殖、代谢及活性都有着一定的抑制作用，并可引起黄孢原毛平革菌细胞的死亡，从而大大降低处理效率。微生物废水处理过程要求微生物有足够的活细胞生物量或者细胞活性，才能实现较高的处理效率。

一些传统的检测方法，例如干湿重法、血球板计数法、平板菌落计数法及荧光显微镜计数法等已经广泛应用于检测微生物的活性，但传统的方法有诸多缺点，例如：血球板计数法、平板菌落计数法费时费力，并且经常出现技术不准确的情况；荧光显微镜计数法是使用各种染料对细胞进行染色，用显微镜观察死/活细胞呈现的不同颜色而进行计数，这就常常出现染色后死/活细胞呈现的颜色区分不明显，容易混淆的情况。此外，黄孢原毛平革菌是一种丝状真菌，在液体培养过程中，其菌丝很容易缠绕形成直径为3mm左右的菌丝球，即便是在静态培养条件下其菌丝也是缠绕在一起形成大块状或大片状，菌丝与培养液不能形成均一体系，因此传统的方法均不适用于测定其活细胞生物量。而单纯的细胞重量（干重或湿重）不能反映处理体系中菌体的生理状态、衰老程度，甚至不能区分细胞死活。因而，建立一种快速测定黄孢原毛平革菌活细胞生物量，有效评价菌丝体活性的检测方法，对于更好的调控废水处理效率显得十分重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的不足，提供一种简单、方便、可行、有效、能够更准确地测定和反映出重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种重金属胁迫下黄孢原毛平革菌活细胞生物量的检测方法，包括以下步骤：

（1）菌球培养：将黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）加入液态培养基中进行恒温培养，然后向含黄孢原毛平革菌的液态培养基中加入重金属溶液进行胁迫处理，经过滤洗涤后，得到重金属胁迫后的黄孢原毛平革菌菌球；

（2）显色反应：取上述重金属胁迫后的黄孢原毛平革菌菌球加入到无菌噻唑蓝（MTT）溶液中，于30℃～50℃下进行显色反应0.5h～4h（噻唑蓝经显色反应后得到噻唑蓝-甲臜），然后迅速加入盐酸溶液终止反应，得到反应后的混合液；

（3）离心处理：将上述混合液进行离心处理，去除上清液，得到下层沉淀物；

（4）萃取检测：向上述沉淀物中加入萃取剂进行萃取，得到萃取液，测定萃取液的吸光度，表征并计算重金属胁迫下黄孢原毛平革菌的活细胞生物量。

上述的方法中，所述步骤（1）中将黄孢原毛平革菌培养至生长对数期，培养温度优选30℃～39℃。

上述的方法中，步骤（1）中所述胁迫处理的时间优选2h～48h，所述胁迫处理的温度优选30℃～39℃。

上述的方法中，步骤（1）中所述重金属溶液优选含镉、铅、铜、铬中一种或几种的重金属溶液；当重金属溶液为含镉溶液时，重金属溶液中镉离子的浓度优选1μmol/L～500μmol/L。

上述的方法中，步骤（2）中所述无菌噻唑蓝溶液的浓度优选1g/L～5g/L，所述盐酸溶液的浓度优选0.2mol/L～1mol/L。

上述的方法中，步骤（3）中所述离心的转速优选8000rpm～10000rpm，离心的时间优选2min～10min。

上述的方法中，步骤（4）中所述萃取剂优选二甲基亚砜、甲醇、丙酮或异丙醇，特别优选异丙醇。

上述的方法中，步骤（4）中所述萃取的时间优选2h～4h。

上述的方法中，步骤（1）～步骤（3）所需用器皿均需灭菌处理，所用试剂溶液均用无菌液配置。