[发明专利]一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种ELISA检测方法，具体地说是一种检测鹅促卵泡素(FSH)的双抗体夹心ELISA检测方法。

背景技术

促卵泡素（follicular stimulating hormone，FSH）是一种由动物脑垂体前叶分泌的糖蛋白类促性腺激素，有α和β两个亚基组成，分子量约为30KD。主要的生理作用是促进雌性动物子宫内膜生长、排卵、刺激多卵泡发育及刺激雄性动物精子发生，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。

由于缺乏有效的分析鹅和其他家禽血液FSH浓度的方法，难以较好检测禽类FSH的血液浓度和变化，严重影响对鹅和其他家禽产蛋和卵泡发育的调控的研究工作开展。目前国内外对FSH的定量测定大多采用RIA法，该法灵敏度高，但存在放射性核素污染，试剂保存期短、特殊设备等缺点，难以满足大多数实验室和临床的要求。ELISA因其灵敏度、特异性高，简单快速，重复性较好，避免了RIA的缺点，受到众多不具备放免测定条件的实验室的欢迎，而且国内外许多厂商开发了分别适用于人、鼠、猪、羊、牛和兔等哺乳动物的FSH的酶联免疫分析（ELISA）试剂盒。这些试剂盒中所使用的FSH大多是从猪、牛和羊垂体中提取，不仅FSH纯品获得困难，提取纯化的工艺步骤复杂、难度也大，使目前的试剂盒售价均高昂。尽管如此，目前仍然缺乏可适用于禽类的FSH浓度测定ELISA方法。由于禽类的FSH与哺乳动物FSH之间存在较大的氨基酸残基序列差异，使得市售的哺乳动物ELISA试剂盒无法应用于测定家禽如鹅和鸡血液中的FSH浓度。随着对家禽卵泡发育和产蛋调控技术等研究的深入，迫切需要开发一种适用于测定禽类FSH的ELISA分析方法。

本发明利用基因工程技术制备鹅FSH的两亚基和标准分子的重组蛋白，并通过制备相应的高特异性抗体，建立了具有灵敏、特异、准确、方便操作的鹅FSH的ELISA检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于鹅和其他家禽FSH双抗体夹心ELISA检测方法。

本发明的目的是这样实现的：一种鹅FSH的双抗体夹心ELISA检测方法，包括双抗体夹心ELISA检测方法涉及的试剂盒步骤，其特征在于，首先克隆鹅的FSH α和β亚基的成熟肽编码序列，然后构建鹅FSHα和鹅FSHβ成熟肽编码序列的原核表达载体，表达并纯化鹅His-FSHα融合蛋白和鹅GST-FSHβ融合蛋白，以His-FSHα和GST-FSHβ为抗原分别制备高效价、高特异性的羊抗鹅FSHα多克隆抗体及兔抗鹅FSHβ多克隆抗体；同时将FSHα和FSHβ成熟肽编码序列用CTP序列连接，构建成重组FSHβ-CTP-α融合蛋白的真核表达载体，以哺乳动物细胞表达并纯化Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白；

以兔抗鹅FSHβ多克隆抗体为捕获抗体，以羊抗鹅FSHα多克隆抗体为检测抗体，以Fc-FSHβ-CTP-α融合蛋白为标准品，建立检测鹅FSH的双抗体夹心ELISA方法；     所述的FSHα成熟肽编码序列是序列表中SEQ ID No：1；所述的FSHβ成熟肽编码序列是序列表中SEQ ID No：2；所述的重组FSHβ-CTP-α融合蛋白编码序列是序列表中的SEQ ID No：3。

在本发明中，所述的His-FSHα融合蛋白是应用RT-PCR技术钓取鹅FSHα基因序列成熟肽编码序列，构建pRSET-FSHα重组表达质粒，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，IPTG诱导表达His-FSHα融合蛋白，洗涤包含体后用SDS-PAGE电泳分离并从电泳胶上切下特异蛋白条带纯化His-FSHα重组蛋白。

在本发明中，所述的GST-FSHβ融合蛋白是应用RT-PCR技术钓取鹅FSHβ基因的成熟肽编码序列，构建pGEX4T-1/FSHβ重组表达质粒，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，IPTG诱导表达GST-FSHβ融合蛋白，洗涤包含体后用SDS-PAGE电泳分离并从电泳胶上切下特异蛋白条带纯化GST-FSHβ重组蛋白。

在本发明中，所述的高效价、高特异性的羊抗鹅FSHα多克隆抗体是采用纯化的His-FSHα融合蛋白免疫羊，制备并用免疫亲合层析的方法纯化多克隆抗体。

在本发明中，所述的高效价、高特异性的兔抗鹅FSHβ多克隆抗体是采用纯化的GST-FSHβ融合蛋白免疫兔，制备并用免疫亲合层析的方法纯化多克隆抗体。