[发明专利]棘胸蛙抗菌肽及其应用

说明书

技术领域

 本发明涉及一种棘胸蛙(Paa spinosa David)抗菌肽及其应用，属于生物医学领域。

背景技术

抗生素药物的广泛使用导致很多细菌和病毒对现有的抗生素都产生了耐药性，耐药性病原株的扩散使得抗生素的疗效迅速下降甚至消失。因此，寻找以全新的机制杀伤病原微生物，且不易形成耐药性的新型抗生素已经成为目前研究的热点之一。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性高、稳定性低等特点，尤其具有不易产生耐药性的特点，尽管抗菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天，仍被认为是能取代现有抗生素的重要选择。目前，已有多种抗菌肽在进行临床前的可行性研究。

两栖动物皮肤抗菌肽是其先天防御系统中的重要组成成分，由基因编码，核糖体合成，10—50个氨基酸组成，分子表面带有正电荷，大都可形成两亲的α-螺旋结构。不同种属两栖动物的抗菌肽在分子量，氨基酸组成，带电性，疏水性，空间结构和抗菌谱等方面均各自不同。两栖动物皮肤抗菌肽大都是碱性多肽容易与酸性的生物膜层状排列的脂类双分子层相结合，依靠两亲的α-螺旋结构的特点形成跨膜的离子通道，介导一系列的生物效应，可以在不损伤正常细胞的前提下对细菌、真菌、病毒以及癌细胞有抑杀作用。近年来，两栖类皮肤抗菌肽成为国际上动物学、生理学、药理学研究的热点，作为新一代抗生素备受人们关注。

棘胸蛙是主要分布在我国南方地区的蛙类，其生活在山涧林溪，对环境条件要求较高，尤其是水质条件，否则易造成死亡。由于栖息地破坏和野生资源过度利用，棘胸蛙的种群数量已经下降了30%。由于该蛙类野外已相对稀少，生活环境又不同于其他许多蛙类，因而以棘胸蛙为对象，研究与其免疫力有关的抗菌肽基因以及抗菌肽氨基酸组成，有望发现新家族抗菌肽。

发明内容

  本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗菌活性、抗癌活性等特性的棘胸蛙抗菌肽spinosan-D及其用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种棘胸蛙抗菌肽spinosan-D，为SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。

本发明还同时提供了编码上述棘胸蛙抗菌肽spinosan-D的基因，其cDNA由354个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为SEQ ID NO:2所述。

作为本发明的基因的改进：第172-240位核苷酸编码棘胸蛙成熟抗菌肽，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明还同时提供了上述棘胸蛙抗菌肽spinosan-D在制备抗菌类药物中的应用。

本发明还同时提供了上述棘胸蛙抗菌肽spinosan-D在制备抗癌药物中的应用。

本发明还同时提供了上述棘胸蛙抗菌肽spinosan-D的用途：作为抗氧化剂。

    本发明提供了一种具有抗菌活性、抗癌活性、低溶血活性和抗氧化活性的新型抗菌肽，以及该多肽的编码序列和制备方法及其在制药中的应用。

   本发明采用的技术方案为：

1、本发明的抗菌肽spinosan-D，是棘胸蛙基因编码的抗菌肽，棘胸蛙抗菌肽spinosan-D是中国两栖类动物棘胸蛙基因编码的一种单链多肽，分子量为2753道尔顿，等电点为4.51，其全序列为：甲硫氨酸—谷氨酸—谷氨酸—亮氨酸—酪氨酸—赖氨酸—谷氨酸—异亮氨酸 —天冬氨酸—天冬氨酸—半胱氨酸—缬氨酸—天冬酰胺—酪氨酸—甘氨酸—天冬酰胺—半胱氨酸—赖氨酸—苏氨酸—亮氨酸—赖氨酸—亮氨酸—甲硫氨酸，可以形成明显的两亲性α-螺旋结构。

2、本发明的棘胸蛙抗菌肽spinosan-D的编码基因，其为：从棘胸蛙皮肤分离提取总RNA，纯化mRNA，mRNA反转录形成cDNA后，以cDNA为模板，GSP1/3’ RACE Outer Primer为正反向引物，进行第一次PCR扩增，以此产物为模板，GSP1/3’ RACE Inner Primer为正反向引物，进行第二次PCR扩增。

所用引物的核苷酸序列为：

引物GSP1：5’-ATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG-3’；

3’ RACE Outer Primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGATTT-3’；

3’RACE Inner Primer:5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’。