[发明专利]利用四倍体罗汉果雌株直接培育无籽罗汉果的技术

说明书

技术领域

本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育无籽罗汉果，属现代生物技术领域。

背景技术

罗汉果[Siraitia grosvenorii(Swingle)C．Jeffrey]属葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)，为多年生草质藤本植物，雌雄异株，是我国特有的经济、药用植物。罗汉果甜苷属葫芦烷三萜类，罗汉果苷V是世界最强甜味物质之一，甜度是甜菊苷的2倍，甘草甜素的6倍，蔗糖甜度的300倍；不含热量，无任何毒副作用，适宜所有人群，特别是糖尿病、肥胖症和高血压等特殊人群，是国际公认综合性状最佳的天然功能型甜味剂。

罗汉果甜苷存在于果实的果肉和果皮中，但是不含甜苷成分的种子占整果的50%，种子内的油脂增加了罗汉果甜苷提取、纯化的难度和成本。罗汉果种籽多的缺陷造成了甜苷得率低的问题，且很难通过改进提取工艺来解决，使得甜.苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这一问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。采用现代生物技术培育结籽减少或无籽、甜苷含量高的优良罗汉果品种对于推动罗汉果产业的发展具有里程碑意义。

植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不育的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。无籽罗汉果的培育，将大幅提高甜苷含量和整果利用率，有效解决甜苷价格昂贵的问题，使罗汉果更广泛的应用于饮料、食品、保健品、药品等行业。

目前的无籽罗汉果技术都是用二倍体罗汉果雄株与三倍体罗汉果雌株进行杂交，获得无籽罗汉果，该技术获得的罗汉果果实严重变小、变短，目前市场上罗汉果的价格以其性状和大小来区分，因此该技术在生产中无法应用。培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果是解决目前无籽罗汉果推广应用的根本方法。

本发明用四倍体罗汉果雌株直接培育优质无籽的罗汉果，获得的无籽罗汉果具有果形大、甜苷含量高的特性。本发明直接将田间表型好的罗汉果雌株制成脱毒苗，省去了用其种籽萌发、鉴定雌雄才能获得罗汉果脱毒雌株的步骤，省去了一代的时间，缩短了育种周期；同时用果实较大的四倍体雌株为母本，花粉活力高的三倍体雄株为父本进行杂交，使其果实不仅表现为无籽，同时果实具有果形大且甜苷含量高的特性，解决了无籽罗汉果果形小、实际生产无法应用的问题。本发明技术获得的罗汉果果形大、甜苷含量高、整果利用率高，彻底改变了罗汉果种植业的现状，解决了罗汉果甜苷成本高难以广泛应用的难题，推动了罗汉果在食品、饮料、医药等行业的应用，加快了罗汉果产业的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种用四倍体罗汉果雌株直接培育果形大、甜苷含量高的无籽罗汉果技术。该技术利用四倍体雌株与二倍体雄株杂交，获得子代中占50%的三倍体雄株，从高度不育的三倍体雄株中筛选花粉活力高的株系，从500个株系中获得了2个花粉活力高的三倍体雄株，与优良的四倍体雌株杂交，该技术充分结合了三倍体不育、四倍体果实增大的特性，获得的无籽罗汉果果形大且甜苷含量高。

本发明提供了一种无籽罗汉果的培育方法，其特征是所述培育方法通过三倍体雄株与四倍体雌株进行杂交获得无籽罗汉果。具体地，其中所述的三倍体雄株由四倍体雌株与二倍体雄株杂交获得。

更具体地，本发明中所述的四倍体雌株通过以下步骤获得：

a）选取田间表型好的罗汉果雌株茎尖，制成脱毒苗;

b）将消毒完毕的罗汉果茎尖放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽;

c）用秋水仙素进行诱导培养；

d）分析诱导培养后的苗，选取鉴定为四倍体的株系继续培养,即获得所述的四倍体雌株。

其中，上述的罗汉果茎尖是在诱导出芽后15天左右，再切取嫩芽茎尖，用0.2%的秋水仙素诱导36-48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。

本发明还提出了一种无籽罗汉果的田间培育方法，其步骤依次如下：

a）田间按罗汉果常规种植方法种植四倍体罗汉果雌株，每亩种植90-150株；

b）田间种植三倍体罗汉果结实诱导雄株系，按每100棵雌株种植1-5株雄株进行配种。

c）在田间三倍体雄株和四倍体雌株开花时，取三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交，挂果后即得到无籽罗汉果。

其中，上述培育方法的特征在于：田间种植三倍体雄株与四倍体雌株种植比例为1-5:100；用三倍体雄株花粉与四倍体雌株杂交诱导结实；所结果实为无籽罗汉果。