[发明专利]利用分子印迹电化学传感器检测微量赤霉素A3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用分子印迹技术、功能化树枝状大分子放大效应与电化学传感器联用快速测定微量赤霉素的方法。

背景技术

赤霉素（Gibberellin，GA）是一类非常重要的植物荷尔蒙，在农业生产上得到了广泛的应用。赤霉素对植物生长、发育的各个阶段起着调节作用，对蔬菜水果等有着显著的增产效果。不同的赤霉素生物活性不同，而赤霉素A3（GA3）的活性最高。但是，有研究表明，在长期使用后赤霉素可能在人体中富集积累，引起慢性中毒，甚至癌变，对人类健康造成安全隐患。目前，一些发达国家已经对水果、蔬菜以及啤酒中的赤霉素最高残留限量做出了严格规定。因此，寻找一种快捷、方便、高灵敏、低检出限的检测痕量赤霉素的方法具有重要意义。分子印迹是近年来兴起的分子特异性识别技术，将分子印迹技术与电化学分析技术结合起来，可以得到高灵敏度、高选择性的生物传感器，目前已经有相关报道，但是应用于微量赤霉素的检测暂未有相关研究。

发明内容

本发明在于提供一种高灵敏度、高选择性且区别于酶放大的功能化树枝状大分

子标记放大效应,利用分子印迹电化学传感器检测微量赤霉素A3的方法。

构思如下：传统的分子印迹电化学传感器，由于每个印记空穴只能够对应一个探针，故传感器的灵敏度受限于印记孔穴的数目，有进一步提高的空间。树枝状大分子是一类新型的人工合成的高分子，由于其表面存在大量的官能团，所以能够通过使其功能化后再与模板分子相连，从而使一个印记空穴能够对应多个探针，从而增加传感器的灵敏度。在本实验中，与Fe³⁺络合的聚酰胺-胺标记的赤霉素分子作为探针。基于过氧化氢能够氧化对苯二酚产生对苯醌，对苯醌在电压的作用下失去电子得到对苯二酚。而Fe³⁺能够催化降解过氧化氢，从而降低了电极附近过氧化氢的浓度，进而降低了反应产生的对苯醌的浓度，则对苯醌还原生成对苯二酚的还原峰强度显著降低。此外，引入了树枝状大分子标记放大，代替了成本较高的酶，很好的提高了灵敏度和降低了检测成本。电化学信号的改变是通过待测液中的赤霉素A3竞争取代分子印迹膜上已孵化上的功能化树枝状大分子标记的赤霉素A3来达到的。待测液中的赤霉素A3浓度越大，竞争能力越强，使得电极表面的标记的赤霉素A3量减少，即罗丹明B与底液中过氧化氢反应量减少，增加了氧化产生对苯醌的数量，使检测的电化学信号增强，这样即可达到间接地检测赤霉素A3的目的。

本发明涉及功能化树枝状大分子标记放大效应的分子印迹电化学增敏技术。当待测分子赤霉素A3与电极表面的分子印迹膜上功能化树枝状大分子标记的赤霉素A3进行竞争取代时，树枝状大分子上的Fe³⁺与底液中的过氧化氢发生催化降解反应，从而大大降低了电极附近对苯醌的浓度。差分脉冲伏安法测定的还原峰信号与待测赤霉素A3的浓度在3×10^-7 mol/L～6×10^-9 mol/L范围内呈良好的线性关系。

具体步骤如下：

（1）金电极的处理：

将金电极依次用1.0 μm、0.3 μm和0.05 μm氧化铝粉进行表面抛光处理，然后依次在体积百分比浓度为50%的硝酸和无水乙醇中各浸泡洗涤5 min，取出后在纯水中超声洗涤5 min，然后在0.5 mol/L H₂SO₄中于-0.2～1.0 V进行电化学处理，直到获得稳定的循环伏安曲线。

（2）赤霉素A3分子印迹电化学传感器的制备：

将步骤（1）处理干净的金电极置于含1.0×10^-3 ～ 2.0×10^-3 mol/L邻苯二胺、5×10^-4 mol/L GA3的混合溶液中，在0V～0.8V间于50 mV/s的扫描速率用循环伏安法扫描30圈；取出金电极并用二次蒸馏水冲洗干净后静置晾干；再将金电极放入体积比为8:1的无水甲醇-冰乙酸体系中，在搅拌下洗涤金电极表面的聚合膜3 min，用蒸馏水冲洗干净后静置3 ～ 5 min,然后把金电极浸入赤霉素A3的过饱和水溶液中10～30 min，以便赤霉素A3分子能够掩蔽所有的在洗脱步骤中形成的分子印迹孔穴；然后在10^-3 mol/L功能化树枝状大分子标记的赤霉素溶液中孵化5～30 min，从而制成赤霉素A3分子印迹电化学传感器。

（3）检测方法：