[发明专利]产纤维素酶的突变菌株、高效表达目的蛋白的突变菌株及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种高效表达生产纤维素酶的方法，主要涉及三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755和这三个基因的系列突变菌株，纤维素酶诱导物及诱导条件的发现及应用，以及利用三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755的系列突变菌株作为基础菌株构建目的蛋白表达系统，涉及表达宿主菌的构建、启动子序列及诱导条件。

背景技术

纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的可再生资源。目前，自然界中纤维素只有一少部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。纤维素分子是由成千上万个葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键连结而成的链状聚合体，几十个纤维素分子平行排列组成小束，几十个小束则组成小纤维，最后由许多小纤维构成一条植物纤维素。纤维素分子难以直接被利用，需经过降解成小分子糖类物质才可被利用。纤维素可以通过酸、碱及酶处理来降解。酶法降解纤维素由于污染低、能耗低被逐渐认可。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，一般将纤维素酶分为三类，外切－纤维二糖水解酶（CBH），内切-葡聚糖酶（EG1、EG2、EG3等）和β-葡萄糖苷酶（BG），这些酶系中的各组分通过协同作用共同降解微晶纤维素。纤维二糖水解酶在纤维素糖链的还原端或非还原端以渐进的方式切割，释放出纤维二糖，是纤维素酶系的主要成分，其外切酶活力对微晶纤维素降解是至关重要的。β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖水解成葡萄糖，从而去除纤维二糖对纤维素酶，特别是外切酶的抑制作用，因而有效提高纤维素的降解效率。

纤维素酶的生产可采用液体发酵、固体发酵两种方式。由于丝状真菌纤维素酶为胞外分泌型，因此液体发酵在无菌控制和产品分离等方面具有明显优势，适合现代发酵技术应用。但是，目前液体发酵纤维素酶还有很多不足，比如需使用槐糖、乳糖、结晶纤维素等作为诱导剂，这些诱导剂比较昂贵，导致其生产成本过高。利用现代生物技术，通过分子改造，提高纤维素酶的发酵水平，是纤维素酶产业化未来必由之路。尽管传统物理诱变方法在过去已经取得了显著进展，但由于诱变造成的突变难以摸清，很难重复，因此对诱变菌株进行分子水平的基因改造更加困难。对菌株的分子改造包括突变或敲除一个或多个基因，改变一个或多个基因表达水平。基因改造通常都要进行遗传转化，但工业纤维素酶真菌通常转化效率低，而且对于没有有性生殖菌种来说（如黑曲霉）要同时突变2个基因非常耗时，如果需要同时突变5个以上基因，难度极大。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种真菌产纤维素酶的方法，是通过改造（敲除、突变等）微生物的β-葡萄糖苷酶基因，得到基因突变菌株，然后利用该基因突变菌株发酵生产纤维素酶，并在发酵过程中添加特定诱导物生产纤维素酶。

围绕该主要目的，本发明的另一目的是提供一种目的蛋白质表达系统，含宿主菌株、表达启动子及表达诱导条件。

因此，第一方面，本发明提供用于生产纤维素酶的双基因突变菌株，能够在纤维二糖诱导条件下表达含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2在内的纤维素酶系；为以下菌株之一：

a.命名为BG13(NCU00130×NCU08755)的双基因突变菌株，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755的微生物菌株；

b.命名为BG12(NCU00130×NCU04952)，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU04952的微生物菌株；

c.命名为BG23(NCU04952×NCU08755)，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU04952和NCU08755的微生物菌株；

所述微生物为脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）或侧孢霉（Sporotrichum）；优选为粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）。

所述β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下：

1）β-葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；β-葡萄糖苷酶基因NCU00130编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；