[发明专利]用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质研究技术，特别是一种用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测方法及载体试剂盒。

背景技术

目前用于蛋白质互作的检测技术有酵母双杂交技术（Yeast two hybrid，Y2H）、荧光共振能量转移技术（FRET）、化学发光共振能量转移技术（BRET）和双分子荧光互补技术（BiFC）等等。

酵母双杂交系统（Y2H）利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。荧光能量共振转移（FRET）是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象，当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。双分子荧光互补技术（BiFC）是将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光，作为报告蛋白，直接反映目标蛋白质蛋白质之间的相互作用。

基于双分子荧光互补技术，发明人的前期研究中提出荧光素酶互补图像检测技术LCI技术(Huamin Chen,et al;2008,Firefly Luciferase Complementation Imaging Assay for Protein-Protein interaction in Plants.Plant Physiology.Vol.146,pp.368~376)，当检测两种目标蛋白是否互作时，将荧光素酶分成N端（NLuc）片段2~416和C端（CLuc）398~550两部分作为报告蛋白，将编码N端（NLuc）片段和C端（CLuc）片段的基因分别构建到不同的表达载体上得到N端载体和C端载体，在N端载体上N端（NLuc）片段的氨基端载入一种目标待检测蛋白的基因得N端检测载体，在C端载体上C端（CLuc）片段的羧基端载入另一种目标蛋白的基因得C端检测载体。将N端检测载体和C端检测载体的表产物混合在一起，目标蛋白下游两部分报告蛋白不会自发地装配起来，仅仅当与这两部分报告融合的目标蛋白之间可以互作时，两部分报告蛋白才能够正确地组装并产生活性，在加入发光底物后，可以通过特定仪器来检测其化学发光情况，如果发光情况判断两种目标蛋白之间是否存在互作。LCI技术可以利用原生质体表达系统，也可以利用农杆菌介导的瞬时表达系统来完成蛋白互作的检测或验证，LCI检测的是群体细胞的结果，而非单一细胞内的结果，因此有效避免了细胞个体所造成的假象，排除了细胞自发荧光的干扰。

但前期LCI表达载体其多克隆酶切位点单一，当进行蛋白质互作验证时，待测定基因克隆入表达载体具有很多局限性，仅仅适合于2个待测蛋白互作的验证，不方便于高通量的蛋白质互作筛选。

Gateway技术（Invitrogen）：能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统，并且大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，去除了冗长的亚克隆步骤，同时克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便地穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，因此Gateway技术被多数实验室广泛使用。

目前尚未见到将gateway技术与LCI技术相结合的报道。

发明内容

本发明根据上述领域的空白，提供一种简捷、方便，同时也可以方便地适用于大规模的蛋白互作筛选和验证的方法及相应的LCI表达载体试剂盒。

本发明的技术方案如下：

用于检测蛋白质互作的荧光素酶互补图像检测的表达载体，N端载体为表达荧光素酶N端2~416位多肽片段Nluc的pNG或pUC-Nluc-G，C端载体为表达荧光素酶C端398~550位多肽片段Cluc的pCG或pUC-Cluc-G，