[发明专利]一种关节软骨移植物及其制备方法

权利要求书

1.一种关节软骨移植物的制备方法，其特征在于，从哺乳动物正常软骨组织的浅层、中层和深层分别获得各层的软骨细胞，将浅层软骨细胞与交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加转化生长因子-β后得到浅层细胞溶胶，将中层软骨细胞与交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加糖胺聚糖、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子后得到中层细胞溶胶，将深层软骨细胞与交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加糖胺聚糖、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β后得到深层细胞溶胶；采用三维打印技术，将浅层、中层和深层细胞溶胶按照软骨缺损部位的大小、形状和厚度，从浅层至深层的顺序分层打印，再经体外培养得到关节软骨移植物；各层之间通过交联的Ⅱ型胶原溶胶自然凝固复合而成；所述浅层软骨细胞、中层软骨细胞和深层软骨细胞分别来源于哺乳动物源性正常软骨组织的浅层、中层和深层；所述交联的Ⅱ型胶原溶胶是指将Ⅱ型胶原配制成溶液，在0℃条件下紫外线照射0.5～5小时或在0～40℃条件下加入1/5～1/10体积的质量体积浓度为0.01～2％的京尼平水溶液，交联时间为0.5～3小时，再调节pH至中性。

2.根据权利要求1中所述关节软骨移植物的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤一、软骨细胞获取：将哺乳动物源性0.5～3mm³大小的正常浅层软骨组织先用0.05～0.2％透明质酸酶溶液消化15分钟～1小时，每15分钟振荡一次，消化结束后用磷酸盐缓冲液冲洗2次；再用0.15～0.25％的Ⅱ型胶原酶溶液消化1～10小时，待组织解散，细胞间疏松时用磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，分离出原代浅层软骨细胞，按细胞密度1×10⁴～5×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，37℃、5％CO₂条件下进行原代培养；培养3～7天，浅层软骨细胞达到80～90％融合时传代，用0.1～0.5％胰酶溶液消化2～10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度1×10⁴～5×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，每3～7天传代一次，每3天换液一次；将哺乳动物源性0.5～3mm³大小的正常中层软骨组织采用0.1～0.2％Ⅱ型胶原酶溶液消化1～15小时，待组织解散，细胞间疏松时用磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，获得中层软骨细胞，按细胞密度1×10⁴～2×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，37℃、5％CO₂条件下进行原代培养；培养3～7天，中层软骨细胞达到80～90％融合时传代，用0.1～0.5％胰酶溶液消化2～10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度1×10⁴～2×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，每3～7天传代一次，每3天换液一次；将哺乳动物源性0.5～3mm³大小的正常深层软骨组织先用0.05～0.15％Ⅹ型胶原酶溶液消化0.5～2小时，消化结束后用磷酸盐缓冲液冲洗2次，再用0.05～0.15％Ⅱ型胶原酶溶液消化1～10小时，待组织解散，细胞间疏松时磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后磷酸盐缓冲液洗涤2遍，获得深层软骨细胞，按细胞密度5×10⁴～5×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，37℃、5％CO₂条件下进行原代培养；培养3～7天，深层软骨细胞达到80～90％融合时传代，用0.1～0.5％胰酶溶液消化2～10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度5×10⁴～5×10⁵个/cm²接种，加入培养液A，每3～7天可传代一次，每3天换液一次；上述消化分离原代细胞过程中所用消化酶溶液浓度均为质量体积比，使用体积为软骨组织体积的10倍，上述原代及传代培养消化过程均在37℃、5％CO₂条件下进行；所述培养液A的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL和维生素C 50～100μg/mL；

步骤二、软骨细胞溶胶制备：用体积浓度为5‰的醋酸溶液溶解Ⅱ型胶原，4℃搅拌过夜后经紫外线或京尼平交联，制备15～30mg/mL、10～20mg/mL和6～15mg/mL交联的Ⅱ型胶原溶胶；所述紫外线或京尼平交联是指在0℃条件下紫外线照射0.5～5小时或在0～40℃条件下加入1/5～1/10体积的质量体积浓度为0.01～2％的京尼平水溶液，交联时间为0.5～3小时；分别将步骤一获得的第2～5代各层软骨细胞分别离心，弃去上清；用培养液A调整浅层软骨细胞悬液浓度为2×10⁶～6×10⁷个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按体积比1:1与15～30mg/mL交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加终浓度为5～10ng/mL的转化生长因子-β，制备成浅层细胞溶胶；用培养液A调整中层软骨细胞悬液浓度为5×10⁵～2×10⁷个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按体积比1:1与10～20mg/mL交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加终浓度为1～10mg/mL的糖胺聚糖、1～5ng/mL的转化生长因子-β和1～50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子，制备成中层细胞溶胶；用培养液A调整深层软骨细胞悬液浓度为5×10⁴～5×10⁵个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按体积比1:1与6～15mg/mL交联的Ⅱ型胶原溶胶混合，添加终浓度为5～30mg/mL的糖胺聚糖、5～100ng/mL的骨形态发生蛋白和1～20ng/mL的转化生长因子-β，制备得到深层细胞溶胶；

步骤三、关节软骨移植物的构建：采用步骤二制备的浅层、中层和深层细胞溶胶，使用三维打印快速成型机从浅层至深层逐层打印关节软骨移植物，关节软骨移植物的浅层打印厚度为0.02～0.5mm，中层打印厚度为0.1～1.4mm，深层打印厚度为软骨损伤部位的总厚度与已构建的浅层、中层关节软骨移植物的差值；每层打印完成后，在37℃条件下固化10～30分钟，构建完成关节软骨移植物；

步骤四、关节软骨移植物的培养：将步骤三获得的关节软骨移植物置于培养液B中，超过关节软骨移植物高度2～3mm，37℃、5％CO₂条件下培养3～10天，每3天换液1次，制备得到关节软骨移植物；所述培养液B的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺146～585μg/mL、维生素C为50～100μg/mL、转化生长因子-β1为5～10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子-2为5～25ng/mL。