[发明专利]一种离体高效构建多拷贝乳酸克鲁维酵母表达载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是乳酸克鲁维酵母表达载体，特别是一种离体高效构建多拷贝的乳酸克鲁维酵母表达载体的方法，可人为控制外源基因插入拷贝数并且可用于基因剂量效应研究，是酵母表达载体的一种有利的改造。

背景技术

近年来，酵母表达系统引起了广泛的重视, 并逐渐被用于药用蛋白质的生产。它既有像原核细胞系统生长快、便于基因操作和可以被大规模培养等优点, 同时又有真核细胞具备的翻译后加工、糖基化修饰能力, 能生产有生物活性的重组蛋白等诸多特点。作为最简单的真核生物之一, 乳酸克鲁维酵母培养成本低廉, 已长期用于工业规模生产。其表达水平高, 工程株构建周期短, 表达系统不含任何病毒来源的元件, 不产生内毒素。乳酸克鲁维酵母还具有真核细胞的大部分翻译后修饰功能, 包括简单的糖基合成功能。为了获得外源蛋白的最大表达，研究者们致力寻找高效的工业化菌株。目前所熟知的商业化菌株 GG799 是乳酸克鲁维酵母野生单倍型菌株, 已应用于食品工业之中, 具有较良好的蛋白合成与分泌能力。乳酸克鲁维酵母常用的表达载体有：pKLAC₂ 。

乳酸克鲁维酵母常用的表达系统仍然无法满足日趋增长的产量需求，它的表达量和稳定性都有待提高。

于是基于分子水平上的各种载体改造成为新的出路。T. Knight建立了一套新的的克隆策略并将其命名为“生物砖”，这种克隆策略可以使生物组件之间能够标准化装配，跟传统的机械制造一样，各种组件之间具备相应的标准接口，可以以标准的方式将这些组件进行连接然后装配并形成更大的组件。每个生物砖都是一段特殊的DNA，它包含特定的信息以及编码相对应的信息都具有特定功能。例如，一段特殊的DNA可能是启动子，核糖体结合位点，编码蛋白质的序列，终止子等其中之一，也可能是这些基本部件的组合体。某些特定的酶切位点一般包含在每个生物砖的上游及下游，需要通过传统的酶切连接反应，就可以将任意一个标准化后的生物砖组件和其他的生物砖组件按照人们的意愿进行组合，并且新的组合序列依然可以用于下一个组合，仍然是标准化的生物砖组件。不断重复这样的操作，可以利用简单的手段，从最简单的组件开始建立，最终可以构建大规模的复杂系统。简单的说，生物砖就是一段DNA，这段DNA含有特殊酶切位点和特定功能。一个标准化的生物砖 有三个重要部分组成：前缀(prefix)，主体(body)和后缀(suffix)。其中主体部分是一段可以发挥特定功能的DNA序列，可以是调节基因，也可以是编码蛋白质基因或终止子等，也可以是它们之间的组合。其中含特殊酶切位点的序列包括在前缀（prefix）和后缀（suffix）中，起到类似于传统机械制造中接口的作用。

应用基因改造和生物砖技术能够提高乳酸克鲁维酵母表达蛋白质基因的表达量和稳定性。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程的手段构建能够人工选择插入外源基因拷贝数的表达载体，并成功表达甘露聚糖酶，提供研究乳酸克鲁维酵母中基因剂量效应与蛋白表达水平关系的技术方法。

本发明是这样实现的。其步骤为： 

1、设计合成PCR引物。根据商品化的乳酸克鲁维酵母 Kluyveromyces lactis GG799的载体pKLAC₂基因序列，设计合成PCR用的10个引物（见表1）。

                                                              表格