[发明专利]一株灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产漆酶和β-葡聚糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产漆酶和β-葡聚糖的菌株，特别涉及一种漆酶与灰树花β-葡聚糖联产的菌株和生产方法。 

背景技术

灰树花（Grifola frondosa）又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑，在分类学上属于担子菌亚门、多孔菌科、多孔菌属。长期以来人们对灰树花进行的大量研究主要集中在多糖方面，而对其产酶特性的研究极少。 

1883年，日本学者吉田首次从日本紫胶漆树漆液中发现一种可催化漆固化过程的蛋白质。1894年，Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶(Laccase)。漆酶（Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的作用底物，不仅能氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除有机废水的毒性。近年来在造纸、环保、食品等领域有了广泛的应用。 

我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等，他们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶酶活的测定方法。但直到20世纪80年代末，国内对漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表观特性的描述性研究上。 

专利CN201010289892.3公开了一种利用密孔菌属菌株以豆粕(或硝酸钠)为氮源、以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶的方法；专利CN200810198678.X公开了一种产漆酶的灵芝菌株，该灵芝菌是韦伯灵芝TZC1(Ganoderma weberianum TZC1)，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.2648；赵玉良等报道了一种利用灰树花发酵制备漆酶的方法，其所用菌株购自上海食用菌研究所，为灰树花子实体栽培菌株，液体培养采用葡萄糖天冬酰胺培养基，26℃下,摇瓶液体培养10天，发酵液中的酶活达到最高值,期间采用1.5%浓度的木质素进行产酶诱导。所产漆酶采用30%的硫酸铵沉淀回收。上述漆酶制备方法中，仅仅是利用灰树花菌株发酵制备漆酶，通过硫酸铵沉淀获得粗酶，未涉及如何利用灰树花发酵菌丝体，由于发酵的目标产物和发酵时间不同，使得菌丝体内的多糖构成和多糖的含量均与现有的不同。以葡聚糖为目标产品时，发酵周期仅为48-96h，而以漆酶为目标产物时，发酵周期长达196-240h，此时菌丝体老化，或者易发生自溶而消亡，或者多糖开始变化，水溶多糖减少，有生物活性的β-葡聚糖大量损失。菌丝体一般被当做废弃物低价出售，不及时处理时，会因腐烂造成环境污染。另外，在漆酶的分离过程中，使用了高浓度的硫酸铵作为沉淀剂，分离漆酶之后的发酵液成为高浓度含盐废水，虽然含有大量的N元素，但由于含S元素过高，不能直接作为肥料使用，需耗费大量资金进行处理才能够达标排放。且以硫酸铵作为沉淀剂，实际上是实验室中作为分离蛋白质的常用方法，不适于工业化应用。因此该方法无法应用于实际生产中，缺乏使用价值。 

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一株的灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1709，该菌株可以用于生产漆酶。发明人发现其发酵菌丝体中含有大量β-葡聚糖，故该菌株可用于β-葡聚糖的生产。此外，发明人还发现经过适当调整后在灰树花的发酵液中，含有大量漆酶活性的蛋白，因此可利用该菌株作为漆酶的产生菌。利用该菌株发酵生产漆酶，发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β-葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β-葡聚糖联产，适合工业化生产。 

本发明首先获得了一株灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1709，发明人进一步发现通过调整发酵工艺，该菌株既可产生漆酶，又可产生β-葡聚糖。 

该菌株可以应用于常规生产，特别是可以应用于漆酶及灰树花β-葡聚糖的生产，该生产过程主要包括灰树花液体发酵、固液分离、漆酶分离提取、β-葡聚糖分离提取等步骤。在灰树花的发酵过程中应用了漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序。 

所述的漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序具体步骤如下： 

A.诱导因子筛选： 

从漆酶可以作用的底物、菌株发酵过程所需的生长因子、酶系的调控三个方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或灰树花生长因子或漆酶底物； 

B．诱导因子使用方法： 

含特定金属离子的盐、特定生长因子及漆酶底物添加入培养基中用于调控菌丝体细胞内酶系； 

C．发酵控制：