[发明专利]产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

Rosenfeld等于1983年发现降钙素基因相关肽（CGRP）是一种生物活性肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，但是由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多肽，是目前发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE），比乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10-100倍。

犬钩虫吸血时，其头腺能分泌一种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。目前发现的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重组蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效果明显优于凝血酶抑制剂，AcAPc2作为Xa因子的高效特异抑制剂对血小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。1998年，Donnelly等报道AcAPc2在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。

然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。

本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。

所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：

一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；

二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2；

三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。

本发明的有益效果：本发明基因工程菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2之间作用互补且协同增效，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1%。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。

具体实施方式二：具体实施方式一所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式三：具体实施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：