[发明专利]3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说是一种3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化方法。

背景技术

脂肪前体细胞是一类能够增殖并向脂肪细胞分化的特异化的前体细胞。它是成熟脂肪细胞的前体。在开始向脂肪细胞分化前，脂肪前体细胞形态上类似成纤维细胞，呈长梭形。开始分化后，脂肪前体细胞逐渐丧失长梭形的形态，向圆球形转变，同时细胞内甘油三脂的含量逐渐上升，细胞骨架蛋白等的含量下降。细胞内出现脂滴，脂肪前体细胞逐渐向成熟脂肪细胞转化。由于脂肪前体细胞不含脂滴，体积小，有促血管生成特性，在细胞的收集与移植过程中比成熟的脂肪细胞更能耐受缺血与创伤，尤其在脂肪移植后的缺血期，使单个细胞比块状脂肪更易通过细胞融合而成活。

研究显示抑制RAS可以减少糖尿病的发病及并发症的产生，但多项研究并未发现糖尿病患者血液中肾素或是血管紧张素II有所增高，随着多组织包括胰腺组织、脂肪组织、心脏组织中表达RAS各成分的发现，人们越来越关注局部RAS的激活是否在糖尿病及其并发症的发生发展中起到重要作用。

研究证实人类脂肪细胞可产生RAS的各种成分包括血管紧张素原、肾素或肾素样活性物质、血管紧张素转换酶、血管紧张素Ⅱ1型和血管紧张素Ⅱ2型受体。近年来的研究更发现，人类脂肪组织还可表达肾素受体及血管紧张素转化酶2。脂肪组织其释放的血管紧张素原不仅是局部RAS的重要来源，更是循环RAS的重要组成成分。研究结果提示脂肪组织局部存在几乎所有RAS的相关组分，其不仅作用于局部组织更是作为循环RAS的重要组成作用于全身各组织。因此其对糖尿病的发病及并发症发生也有重要影响。

由于脂肪组织在机体分布广泛，包括皮下脂肪、内脏周围脂肪、血管周围脂肪等，因此局部RAS其作用范围广泛。肾素-血管紧张素系统不仅可反馈作用于脂肪细胞，影响其增生分化及脂肪代谢。此外脂肪细胞分泌的血管紧张素Ⅱ还可以促进各种炎症因子如白介素-6、TNF-α，I趋化分子-1(ICAM-1)，血管细胞趋化分子-1(VCAM-1)等的表达和释放，从而参与糖尿病发病及并发症的病理生理过程。

然而脂肪组织中RAS的表达变化调节因素多样，机制尚不明确。且由于作为血管紧张素前体的血管紧张素原在脂肪组织中大量表达，许多研究主要集中在脂肪组织内血管紧张素原的生成、调节和释放方面，而对RAS其他各成分的变化并不十分明确。

为了建立脂肪前体细胞培养体系，研究局部脂肪组织中RAS的激活在糖尿病及其并发症的发生发展中起到作用具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂肪前体细胞诱导分化方法，用于研究局部脂肪组织中RAS的激活在糖尿病及其并发症的发生发展中起到作用。

一种3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化方法，包括以下步骤:

（一）3T3-L1前脂肪细胞株的复苏：从液氮种取出细胞株，立即置于37℃水浴箱中，至细胞液完全溶解时取出，将复苏的细胞加入在室温1000rpm离心5min，弃去上清，再加入培养液，吹打重悬，将重悬的细胞及培养液吸入培养皿中，显微镜下观察细胞形态及数量，将培养皿置于5%CO₂的37℃恒温培养箱中培养；

（二）3T3-L1前脂肪细胞株的培养：显微镜下见细胞贴壁，呈梭行，透亮，细胞每2天更换1次培养液，倾斜培养皿，将培养液用移液管移去，沿壁加入培养液；

（三）3T3-L1前脂肪细胞株的传代：显微镜下见细胞贴壁，呈梭形或多角形，细胞密度约80%，倾斜培养皿，将培养液用移液器移去，沿壁加入温热的PBS溶液6ml，晃动培养皿后，用移液器移去，重复一次，加入Trypsin进行消化，显微镜下见细胞由不规则多角形或梭形收缩成圆形，过程约30秒，加入培养液终止消化，用移液器吹打，使细胞脱离培养皿底，吸入离心管中，1000rpm离心4min，倾去上清，加入培养液，吹打使细胞分散；取含有细胞的培养液加入孔板，置于5%CO₂的37℃恒温培养箱中培养；

（四）3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化：上述传代细胞培养至完全长满后3天开始诱导分化；加入含有诱导剂（1.0uM地塞米松，1.0mM IBMX，1.7uM胰岛素）和小牛血清（10%）的DMEM培养液，培养2天；显微镜下见少数细胞呈圆形，并有脂滴出现；加入仅有1.7uM胰岛素(1.7uM）、小牛血清（10%）的DMEM培养液继续培养；继续诱导6天后，显微镜下见细胞基本呈圆形，细胞内含有多个较大的脂滴，即分化为成熟的脂肪细胞。