[发明专利]一种生产靛蓝色素的专用菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌。 

背景技术：

靛蓝(indigo)是一种颜色鲜艳而又稳定的蓝色色素。在结构上，靛蓝是一种芳香族化合物，主要用于布料的染色，如牛仔裤是通过靛蓝将纺织物染色处理后得到的。除了作为染料，靛蓝利靛玉红(一种靛蓝类的色素)在医药行业也有重要应用，能够对一些疾病包括癌症相关疾病、老年痴呆症、迟发过敏症等，有重要的治疗效果。在食品工业中，靛蓝可以作为食品着色的一类添加剂添加到食品中。传统的靛蓝生产主要从植物中提取，一些植物如菘蓝、蓼蓝、马蓝、野青树等叶片中含有丰富的靛蓝色素。通过植物提取的靛蓝安全性高，污染少，但其产量和纯度较低，限制了靛蓝的生产。化学合成法产量高，纯度高，生产工艺相对简单。目前，靛蓝主要通过化学合成法生产。然而，化学合成靛蓝，中于合成中合成原料、催化剂、中间产物等均具有一定的毒性，不但对人体健康有严重影响，而且产生了大量的副产物，如苯胺、硝基苯和金属盐等。这类物质的排放，导致严重的环境污染。微生物催化合成大然靛蓝主要是应用微生物细胞内的酶，在体内或体外催化特定反应，实现生物转化。因其催化反应条件温和、对作用底物有高选择性、降低生产成本、减少能耗、对环境无污染以及绿色安全等特点引起了科学工作者的关注。目前，所报道的微生物催化在靛蓝色素的生产应用中也存在诸多问题：如菌株的培养周期较长，色素分泌能力低，酶在反应介质中不稳定等，故进一步开发微生物资源，筛选靛蓝高产菌株具有重要意义。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种生产靛蓝色素的枯草芽孢杆菌菌株。 

本发明所述的一种产靛蓝的菌株JWDL，其特征在于所述的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年1月9日，保藏号为：CGMCC5698。 

本发明所述菌株在LB固体培养基上37℃培养24h，菌落呈蓝黑色，圆形，不透明，表面褶皱不光滑，边缘不规则扩展。利用透射电镜观察，周生鞭毛，无荚膜，有芽孢，菌体大小为(0.7～0.9)μm×(3～3)μm。生理生化特征见表1。 

表1菌株JWDL的生理生化特征 

注“+”表示生化反应为阳性，“-”表示生化反应为阴性 

对该菌株16sRNA基因进行测序。将所得到的序列用Blast软件和Genbank中已有的16SrDNA序列进行同源性比较，利用软件MEGA4.0构建进化树，结果显示本发明菌株与Bacillus Subtilis(EU543578)聚为一支，序列相似性均为99％，结果见图1。综合JWDL菌株的形态学特征、生理生化特征及16S rDNA核苷酸序列同源性分析结果，将菌株JWDL鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。 

Bacillus Subtilis(EU543578)经发酵试验不能产生靛蓝色素。 

一种用枯草芽孢杆菌菌株生产靛蓝色素的方法，步骤如下： 

(1)平板培养：将枯草芽孢杆菌CGMCC5698的菌种在LB固体培养基上于30-37℃恒温培养； 

(2)种子液的制备：将步骤(1)的单菌落接入种子液培养基30-34℃下恒温培养18小时，转速为180r/min； 

(3)发酵培养：将步骤(2)培养好的种子液接入已灭菌的液体发酵培养基中，恒温培养48-60h，摇床转速200r/min； 

(4)提取枯草芽孢杆菌靛蓝色素：发酵结束后，将发酵液于室温下12000r/min，离心15min，收集深蓝色的菌体沉淀物；上清液加入等体积的丙酮，反复震荡萃取后，12000r/min离心10min，收集含有靛蓝色素的丙酮层；收集的菌体沉淀物用60ml20mmol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液震荡吹打悬浮，再12000r/min，离心10min；如上反复洗涤3次，将非菌体杂质洗掉，离心后的菌体用40ml的丙酮充分悬浮菌体，再在冰浴状态下采用超声法破碎菌体细胞；超声功率600-800W，工作时间18s，间歇20s，工作次数25-35次；第一次超声破碎后的悬浮液10000r/min离心10min，得到深蓝色的上清液利深色细胞碎片沉淀；再次向细胞碎片沉淀中加入丙酮10ml，重复以上超声破碎细胞步骤1-2次；最后将每次超声破碎后获得的蓝色上清液以及丙酮萃取的发酵上清液合并；采用旋转蒸发仪浓缩，然后真空冷冻干燥除掉残余丙酮，得到靛蓝色素。 

发酵培养温度优选32℃。