[发明专利]一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体的说，涉及一种节约时间、成本并提高效率的文库构建方法的改进。

背景技术

通常用Truseq试剂建库所需流程简单，建库成功率高，但费用昂贵，时间长，在建库数目多时要消耗大量时间及费用。而NEB试剂建库虽然费用相对较低，但流程相对繁琐。

混合建库是在Truseq试剂和NEB试剂建库方法上的改进。通过在片段选择步骤前加上可以识别不同文库的Index，然后将不同文库进行混合。该方法与传统方法比会使后续的切胶进行片段选择和PCR步骤上节约大量试剂成本、人力成本及时间。该方法特别适用于基因组小的生物基因组重测序及测序深度低的基因组测序。

发明内容

本发明的一个目的是合成Illumina公司的双链接头，并替换Index，增加Index数量。

本发明提供的双链接头DNA序列分子A，包括正向和反向两条链。正向链5’末端到3’末端与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P7除Index部分6个碱基不同，其余都相同，并在5’末端进行磷酸化修饰；反向链与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P5相同。接头A的结构如图1所示。

前述的与illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列p7相同的寡核苷酸片段，为序列表中序列1的第1-33位和40-63位。

前述的替换的Index部分，为序列1、2、3中的第34-39位。

前述的在正向链5’末端进行磷酸化修饰，为序列表中序列1、2、3的第1位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。

前述的反向链为序列表中序列4。

本发明的第二个目的是运用上述接头A，混合构建不同样品文库；结合Truseq试剂和NEB试剂建库方法，混合构建文库包括如下步骤，如图2所示： 

1）将基因组DNA打碎大小集中在300 bp左右；

2）对步骤1）得到的打碎产物纯化回收之后，进行末端补平。对末端补平的产物进行3’加dATP，将加dATP的产物连上接头A；

3）对步骤2）得到的连接产物进行混合后，跑琼脂糖凝胶电泳分析，如图3所示；根据所需文库大小选择选择片段，如图4所示；

4）将片段纯化并定量后进行PCR扩增，并将扩增产物纯化，然后在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序；

5）进行生物信息分析。

前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤1）中，所述的打碎的条件为使用covaris打碎仪器并调整相应的参数。

前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤2）中，所述的回收打碎产物的方法为采用PCR产物回收试剂盒进行回收；所述的末端补平体系为使用NEB 公司的Quick Blunting kit 进行；所述的加dATP的体系包括：dATP，10×NEB Buffer 2，Klenow exo- 聚合酶，所述的dATP 的浓度为100 mM，所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为25 U/ul；所述的接头A的连接体系包括：接头A，2XQuick Ligation Buffer、Quick T4 DNA Ligase，所述的接头A 的浓度为8 uM。

前述的运用上述接头A，混合构建不同样品文库的方法，其中步骤4）中，所述的纯化采用Qiagen公司的胶回收试剂盒进行回收；PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤3）中得到的连接产物。

进一步地，所述PCR体系包括：引物，聚合酶混合物，以及步骤3）中得到的连接产物包括：引物的浓度为0.2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50%的体积。

本发明的实验证明，本发明提供的接头分子A，能够连接到DNA片段的两端，运用本发明的建库方法，成功的构建了DNA文库，并成功的运用在illumina公司的Hiseq2000的测序平台进行测序，新引入的Index能够将文库很好的分开；同时，可以实现多个样本的混合建库。本发明提供了一种便捷，高效，快速的构建文库的方法，大量节约了试剂成本，人力成本及时间。

附图说明

图1为接头A的结构示意图；

图2为建库流程示意图；

图3为连完接头A的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为连完接头A切胶选择完片段大小的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为2100检测结果；

图6为混合建库测序质控结果。

具体实施方式