[发明专利]牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的制备及其应用方法

权利要求书

1.一种检测牛日本血吸虫病抗体的试纸条，其特征在于该试纸条由部件样品垫、免疫探针干片、层析膜、吸水纸、PVC基板及箭头标签胶膜与手柄标签胶膜组合而成；其中，免疫探针干片是以红色或其它颜色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的羧基，与兔抗黄水牛IgG抗体蛋白的胺基形成共价键结合物后作为免疫探针的检测试剂液吸附于聚脂膜后制成；层析膜是以硝酸纤维素膜为膜基，用划膜喷金机将血吸虫卵可溶性抗原和羊抗兔IgG抗体分别在该膜上画出检测T线和质控C线而成；先将上述前四部件按头尾部分重叠粘合装配在PVC基板上，再将箭头标签胶膜粘贴在免疫探针干片上，另将手柄标签胶膜粘贴在吸水纸上后，用切条机按设定宽度裁切后即成牛日本血吸虫病抗体检测试纸条。

2.一种制备权利要求1所述牛日本血吸虫病抗体检测试纸条的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）免疫探针干片的制备：包括

1）兔抗黄水牛IgG的制备：

① 黄水牛IgG的制备：采集健康黄牛、水牛血液，分别分离血清后取血清各5ml混合，加等量0.85% NaCl，用30%硫酸铵沉淀法提取黄水牛IgG，沉淀的黄水牛IgG用原血清体积2倍量的0.85% NaCl溶解，再用35%硫酸铵沉淀法重复提取2次，最后用5ml 0.85% NaCl溶解离心沉淀的黄水牛IgG，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-后，再用蒸馏水稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，调节蛋白浓度至10mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；

② 黄水牛IgG免疫兔：将黄水牛IgG与弗氏完全佐剂按体积3:7比例制成油乳剂，按黄水牛IgG 6mg/只兔用量，对体重2.5kg的健康雄性家兔，在兔颈部皮下和兔双侧后足蹠垫皮下注射进行首次免疫；后除用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂外，再按上述同样配比、方法，每隔两周进行一次加强免疫，共进行三次；第4次后10天，取耳静脉少量血分离血清，用琼脂扩散法测定免疫血清效价，当血清效价≥1:64时，即可心脏大量釆血、分离血清后，备用；

③ 兔抗黄水牛IgG抗体的制备：取兔抗黄水牛IgG血清10ml，以35%硫酸铵沉淀法提取兔抗黄水牛IgG抗体，以2倍于血清量的0.85% NaCl溶解沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体，如此反复提取3次后，将第3次硫酸铵沉淀的兔抗黄水牛IgG抗体的离心沉淀物以5ml 0.85% NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-；在蛋白测定仪上测定兔抗黄水牛IgG抗体蛋白含量后，用pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液稀释或将透析袋放入PEG中浓缩的方法，将蛋白浓度调节至4mg/ml后，于-20℃密封贮存备用；

2）乳胶微球的洗涤：将直径200nm红色或其它颜色的聚苯乙烯乳胶微球液，在10000 rpm，4℃条件下离心10min，去上清液，沉淀物用高纯水还原为原体积，用超声波分散沉淀的乳胶微球成为均匀悬浮液后，再用上述相同的方法重复离心、重悬浮1～2次；

3）乳胶微球羧基的激活：将pH6.5 0.1mol MES，10%带色乳胶微球的悬液，20mg/mL的EDC·HCl和20mg/mL的NHS，按体积9:2:1:0.75的比例混合、反应2hr；然后在11000 rpm 4℃条件下离心25min，除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积5倍量的pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液；用垂直混合仪混合15min，在11000 rpm，4℃条件下离心25min 除去上清液，沉淀物以所用带色乳胶体积2.5倍量的pH7.20 0.1 M的硼酸缓冲液重悬，以超声波击打还原成均匀的悬浮液，即为羧基活化的乳胶微球；

4）乳胶微球标记兔抗黄水牛IgG抗体：往装有羧基活化乳胶微球悬浮液的离心管中加入等体积以pH7.20 0.1M的硼酸缓冲液稀释成蛋白浓度为1～4mg/mL的兔抗黄水牛IgG抗体，在垂直混合仪上混合反应2hr以上；再加入总体积十分之一量的20%BSA 振荡反应1hr，反应后的混合物以11000 rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以含酪蛋白0.2%～0.5%、蔗糖5%～10%、NaN₃ 0.02%～0.05%的 pH7.2 0.05M Tris-HCl缓冲液构成的封闭液原体积重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，在垂直混合仪上混合15min，再次以11000rpm 4℃离心25min，除去上清液，沉淀物以相当于乳胶微球悬浮液和兔抗黄水牛IgG抗体两者总体积75%的同上封闭液重悬，超声波击打还原成均匀的悬浮液，该液即为红色或其它颜色的免疫探针检测试剂液；

5）免疫探针干片的制备：将上述的免疫探针检测试剂液用划膜喷金机以2～5μl/cm的流速喷涂在已经过含酪蛋白0.2%～0.5%，蔗糖5%～10%，NaN₃ 0.02%～0.05%,Tween-20 0.2%～0.5%的pH7.2 0.05M Tris-HCl缓冲液构成的聚酯膜处理液预处理后的长300mm×宽8.5mm的聚酯膜上，经37℃,1hr烘干，即为免疫探针干片；

（2）层析膜的制备：

    1）血吸虫卵可溶性抗原的制备：按体重2.5～3kg的健康新西兰兔，每只接种血吸虫尾蚴2000条，实验感染兔于接种后45日屠宰取肝脏，分离和纯化血吸虫虫卵，经冷冻干燥后研磨破碎，用0.85%NaCl溶液配成3%～5%悬浮液，2～8℃浸泡3日，再反复冻融10次，冰浴超声波破碎30min，10000r/min离心1hr，取上清液，装透析袋，用pH7.0 0.01M PB透析16小时，每隔4小时换透析液1次，透析结束后，以10000rp离心60min，上清液即为血吸虫卵可溶性抗原；检测其蛋白含量后，用pH8.2～8.5 0.05M TBS稀释至1～7mg/mL浓度，即可用于层析膜上检测T线的绘制；

2）羊抗兔IgG的制备：

①兔IgG的制备：以心脏采血法采集健康新西兰兔的血液，分离血清，取兔血清10ml，再加10ml 0.85% NaCl混匀，用35%硫酸铵沉淀法提取兔IgG，反复沉淀提取3次，沉淀物用5ml 0.85% NaCl溶解后，用透析法除去硫酸铵，并在蛋白测定仪上测定兔IgG的蛋白含量；

②羊抗兔IgG抗体的制备：用弗氏佐剂将兔IgG溶液配制成1mg/ml，用超声波制成乳浊液；按照每千克体重2mg的剂量皮下注射免疫羊，每间隔2周，再用弗氏不完全佐剂和兔IgG制备成相同浓度的乳浊液，以相同剂量与方法免疫羊，第3次免疫后10d颈静脉采血分离血清，以琼脂免疫扩散法测定血清中羊抗兔IgG抗体效价≥1:32以上时，即可大量采集羊血并制取血清；

分离羊抗兔IgG抗体先用30%硫酸铵沉淀法提取粗羊抗兔IgG抗体一次，再用45%硫酸铵沉淀法提取2次，离心沉淀物用5ml 0.85% NaCl溶解，用透析法除去溶液中的NH₄⁺及SO₄^2-，3000rpm离心30min，检测上清液蛋白含量后，用pH8.2～8.5 0.05M TBS将上清液稀释成0.1～2mg/mL的浓度，即可用于层析膜上质控C线的绘制；

3）检测线和质控线的制作：将长25mm×宽300mm的硝酸纤维素膜放在划膜喷金机的操作平台上，在该机1#泵的试剂瓶中加入血吸虫卵可溶性抗原，2#泵的试剂瓶中加入羊抗兔IgG，以1～3μl/cm的流速，在硝酸纤维素膜上划出检测T线和质控C线，两线相距5～6mm，置室内晾干即为层析膜；

（3）样品垫的制备：将23mm×300mm玻璃纤维膜在由含酪蛋白0.01%～0.05%,蔗糖5%～10%、NaN₃ 0.02%～0.05%和Tween-20 0.2%～0.5%的pH7.2 0.04M Tris-HCl缓冲液构成的样品垫处理液中浸泡1hr，取出，37℃烘干即成；

（4）吸水纸的制备：CH37吸水纸裁成长300mm×宽28mm的纸条，置37℃烘干即成；

（5）PVC基板的制备：PVC板其结构为三层，第一层为保护纸，第二层为不干胶，第三层为PVC基板；在保护纸上刻有三条刻痕，分别位于距离一侧长边的20mm、27mm和53mm处；将PVC板按长300mm×宽80mm规格裁剪后备用；

（6）标签胶膜的制备：用不干胶贴纸印制而成；其中，

    1）箭头标签胶膜：其规格为长300mm×宽18mm，在距一侧长边1mm处印有一条直线，在该直线的上方，每隔1.3mm印有一条“←MAX”字样，箭头与直线垂直；指示试纸条样品垫可浸入待测溶液的最大深度不得超过这条直线；

    2）手柄标签胶膜：其规格为长303mm×宽30mm，绿底白字，与长边呈15°夹角印有4列“SjAb”字样，SjAb为Schistosoma japonicum Antibody的缩写，表示该试纸条用于检测日本血吸虫抗体，该部位为试纸条拿取时的手柄部位；

（7）试纸条各部件的组装、切条、包装和贮存：

    1）试纸条各部件的组装：试纸条以长300mm×宽80mm的PVC为基板，依次将300mm ×23mm的样品垫、300mm×8.5mm的免疫探针干片、300mm×25mm的层析膜及300mm×28mm的吸水纸，按头尾各有1～2mm的重叠连接、粘贴在带不干胶面的PVC基板上；再在吸水垫的尾部与免疫探针干片上粘贴上箭头标签胶膜；另在样品垫上粘贴上手柄标签胶膜；各部件压平，粘贴牢固即成试纸条大卡；

    2）切条：将试纸条大卡放在切条机上，按3mm宽度连续切割，即成宽3mm×长80mm的试纸条；

    3）包装与贮存：试纸条抽检合格后，按包装规格要求装入铝箔袋中，放入1小包干燥剂后，封口，即成产品；在 2～8℃保存，有效期为12个月。

3.应用权利要求1所述试纸条检测牛日本血吸虫病抗体的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）血清稀释液的配制：将Na₂HPO_4、KH₂PO_4、NaCl与蒸馏水按重量体积0.199g∶0.082g∶1g∶200ml比例混合，37～40℃水浴加热溶解、冷却后即成血清稀释液；

（2）待检牛血清的稀释：将待检牛血清与血清稀释液按体积1:1～2比例混合稀释；

（3）检测操作：吸取稀释的待检血清0.05ml滴在平放的试纸条的样品垫上，或将试纸条的样品垫端插入待检稀释血清中至箭头标签胶膜所印的直线条15s后，平放在操作台面上；

（4）结果判定：5～15min后观察结果，检测T线和质控C线均呈现红色或其它颜色的同色条带，则判为阳性；仅质控C线呈现1条红色或其它颜色的条带，则判为阴性；检测T线和质控C线均不呈现条带，则说明该试纸条已失效或试验操作有误。