[发明专利]检测结核的表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用，特别是一种检测结核的表面等离子共振生物传感器，制备方法及其应用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的常见的传染性疾病，因其具有较高的发病率和死亡率进而严重威胁人类的健康。据目前的估计，世界上有三分之一的人口（约20亿）为隐性结核病感染者，它是发展中国家一种最主要的疾病。我国现有结核病人450万例，每年因结核病死亡人数近13万。由此可见，廉价、快速的诊断技术在临床上具有重要意义。现有很多种结核病的诊断方法，主要有鉴定结核杆菌、影像学检查及免疫分析等，直接对结核杆菌的分析，如果操作不当，会有再次传播的风险，而且由于结核菌的遗传特性决定了其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂、费时、影响因素较多而不易标准化等缺点；影像学检查对于仪器设备以及操作者具有很高的要求。近年来，人们发现在结核病抗原中，CFP-10是一种结核杆菌早期分泌的抗原，在病人的组织液中存在，这种蛋白在结核杆菌卡介苗或者大部分的非结核杆菌中是不存在的，因此，CFP-10作为结核杆菌的标志物能增强诊断的灵敏度，并减少临床假阳性反应，针对这种抗原的临床分析，对结核病的早期预警和诊断也有重要意义。

近些年来，纳米科技迅速发展并被广泛应用于药物输送，疾病诊断等领域，纳米材料本身具有表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等特性，这也为发展新型高灵敏度、高稳定性、低成本生物传感器提供了新的途径。基于金纳米粒子，碳纳米管，量子点等纳米材料的生物传感器已成功构建。氧化镍纳米颗粒因其能与组氨酸的咪唑基团螯合而进入了研究者的视线，这一性质使得它在生物传感器领域有极大的应用前景，目前研究者主要利用这一性质用于合成蛋白的分离纯化，但氧化镍纳米颗粒在生物传感器中的应用还亟待开发。

表面等离子共振仪（Surface Plasmon Resonance）作为一种新型的技术广泛应用于生物治疗、医学诊断、抗体选择、细胞信号传导等领域的研究。表面等离子共振是一种光学现象，是表面增强拉曼的重要增强机理之一，由于贵金属纳米粒子的尺寸效应及量子效应通过激发光照射能引起表面等离子共振，从而大大增强拉曼散射信号，该体系借助于激光实现信号的输入和输出，从而原位检测天然状态下生物分子间的相互作用，是一种不需要标记且能进行实时分析的工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种检测结核的表面等离子共振生物传感器。

本发明的目的之二在于提供该传感器的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明采用如下机理：根据研究发现，结核患者的尿液中会含有一种蛋白—CFP-10(Culture Filtrate Protein)，CFP-10是结合分支杆菌早起分泌的抗原物质，这种蛋白在没有感染结核或者接种了卡介苗的人中不存在，因此被用作检测结核的标志蛋白，这为结核的检测提供了新的途径，也大大降低了假阳性的概率。首先通过蛋白连接剂将CFP-10的抗体固定在芯片的表面，然后加入CFP-10，CFP-10会通过抗原和抗体的特异性反应结合到芯片的表面，从而引起SPR角的变化，得到相应的信号。本发明为了提高检测的灵敏度，引入了氧化镍纳米颗粒作为信号放大的原件，实验中用到的抗体是带有多组氨酸标记的，组氨酸上的咪唑基团可以与氧化镍纳米颗粒表面的镍离子螯合，从而抗体可以吸附到氧化镍纳米颗粒的表面，本发明利用氧化镍与CFP-10抗体形成的复合物来进行信号放大，具体来说，当加入氧化镍纳米颗粒与CFP-10抗体的复合物时，复合物会通过抗原抗体的反应结合到芯片的表面，由于纳米颗粒具有较好的光学性质，所以在SPR上起到良好的放大效果，进而实现CFP-10的放大检测。

根据上述机理，本发明采用如下技术方案：

一种检测结核的表面等离子共振生物传感器，为双通道表面等离子共振仪。免疫芯片的表面修饰有CFP-10的抗体。

一种制备上述检测结核的生物传感器的方法，该方法的具体步骤为：

a.       免疫芯片的处理：将芯片浸没在水虎鱼溶液中，即浓硫酸：过氧化氢的体积比为3:1，反应45s，然后用超纯水冲洗干净，氮气吹干；

b.      将处理过的芯片浸没在0.1mM 的蛋白连接剂中10小时，蛋白连接剂通过金硫键反应自组装到芯片的表面，然后先后用氯仿、甲醇、超纯水冲洗，氮气吹干；