[发明专利]人工合成用于转基因抗除草剂植物的EPSPS基因

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，本发明涉及一种抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因及其在抗草甘膦植株选育、组织细胞培养中的应用。

背景技术

N-膦酰甲基甘氨酸，也称草甘膦，是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物难以对其产生抗性，低土壤残留量、易于被微生物分解等特点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的除草剂品种。然而由于草甘膦无选择性的杀死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了其在农业上的应用。为了获得抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其中最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦的抗性。

草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。该酶只在植物和微生物中存在，在动物体中不存在。在一些极端环境下，如长期喷洒草甘膦的农田、草甘膦工厂的废液池以及人为的加大对某植株草甘膦的选择压力等，发现了部分对草甘膦具有耐受能力的细菌和植物。如Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，分离到一个耐受草甘膦的矮牵牛细胞系；Baerson等人在长期喷洒草甘膦的果园中发现了一株耐受草甘膦的牛筋草，经过后期实验证明这些抗性的产生均为EPSPS基因发生了突变，导致了其与草甘膦的结合能力降低，并且保证了正常的催化能力。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已经在植物中得到广泛的验证和应用。

在植物和某些细菌中发现的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)对草甘膦具有抗性。在植物中草甘膦的抗性可以通过表达与草甘膦具有较低亲和力的EPSPS而获得，存在草甘膦时此酶也仍然保持其催化活性。植物对草甘膦耐受或对草甘膦具有抗性是指用草甘膦除草剂喷施植物后，植物可以正常生长发育。

现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成酶不发生交叉反应，且两者间的氨基酸同源性低于50％。

在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如：CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987)，CTP在叶绿体膜上从EPSPS酶上裂解下来，产生成熟的EPSPS。叶绿体转运肽对EPSPS酶行使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前提下，如果去掉信号肽，虽然整个植物组织EPSPS蛋白表达量一致，但是植株确不具有草甘膦抗性，不同来源的信号肽对EPSPS蛋白在不同转化受体中行使功能的效率存在差异(Guy della Cioppa 1988，Guy della Cioppa1986)。

密码子偏爱性是一个阻碍细菌基因在植物中表达的障碍。对于一个给定氨基酸的同义密码子，不同的物种会有不同的偏爱性。例如在苜蓿中精氨酸的密码子CGU出现的概率是罕见密码子CGG的50多倍。而在玉米中AGG和CGC是精氨酸常用密码子，CGG也经常被使用。玉米中许多常用密码子却在细菌中很少见，反之亦然。来源于细菌P.luminescens的两个杀虫蛋白基因(tcdA和tcbA)的密码子使用频率中可以发现(Patent No.US6，590，142B1)，丙氨酸的GCG密码子，谷氨酸的GAA密码子，亮氨酸的CTG密码子并没有在这两个细菌基因中使用。但是这些密码子在玉米中的使用频率大约是23％、20％和26％。所以对于来源于细菌的基因在转入植物之前都要根据宿主植物进行基因改造和密码子优化。