[发明专利]一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及到一种用于微量组织中代谢物组和脂质组同时提取并进行基于液相色谱-质谱联用的代谢组学和脂质组学分析的新方法。 

背景技术

肝脏和肌肉组织代谢紊乱涉及到众多疾病的发生发展。基于液相色谱-质谱联用的非靶标和靶标代谢组学和脂质组学分析是研究健康和患病组织代谢的有用工具。在人体活组织检查时能获得的有限的组织量以及常用小鼠模型可得到的少量组织，使得无论在伦理上或是在实际需求上都需要发展一种高效、节省组织用量的代谢物提取流程。人体肌肉活组织检查时经常得到湿重约50mg的组织，相当于干重15mg。在这么少量的组织中，需要做一系列的分析，例如mRNA和磷酸化蛋白的定量、酶学测定、病理学检查、代谢组学和脂质组学分析等，用于获得对机体代谢的全面认知及其分子机理的探究。一些小鼠肌肉组织，如常用的比目鱼肌，干重只有2.5mg，使得尤其需要发展一种从单一少量组织样本中同时提取分析代谢相关产物的方法，而传统的方法提取代谢相关产物往往需要多种提取步骤，消耗大量的组织样本。 

80％甲醇体系是提取具有不同极性的两亲性代谢物的常用方法，而提取甘油三酯等中性的脂质则需要使用亲脂性的有机溶剂。经典的脂质组学提取方法使用氯仿、甲醇、水体系，而氯仿的毒性较大，对实验操作人员存在潜在危害。最近由Matyash等发展的脂质组学提取方法则使用毒性较小的MTBE代替氯仿进行提取。然而到目前为止，全面分析脂质和两亲性代谢物至少需要进行两次提取，这就不可避免导致消耗相对大量的组织样本。 

针对目前常用组织提取方法存在的组织样本用量大、需要多次提取等不足，本发明发展了一种从微量组织中同时提取代谢物组和脂质组的新方法，采用一次提取就可从微量组织得到涵盖不同种类的代谢物，继而通过液相色谱-质谱联用方法进行微量组织的代谢组学和脂质组学分析。 

发明内容

本发明的目的在于建立一种同时提取微量组织中代谢物组和脂质组的新方法。相对于传统的多次提取方法，此方法消耗的样本量少，通量高，且提取效率可与经典的多次提取方法相当。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 

通过甲醇（MeOH)、甲基叔丁基醚（MTBE)、水对待分析的微量组织 样本进行提取；提取完成后离心分离去除固体物质，溶液分为两层，上层主要含有非极性的代谢物和脂质，下层主要含有极性和中等极性的代谢物； 

上下层溶液混合冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的代谢组学分析，上层溶液冻干后复溶进行基于液相色谱-质谱联用的脂质组学分析。 

具体为： 

1）样本制备：将待分析的微量组织样本进行冷冻干燥，并置于-80°C冰箱保存；样本提取前室温解冻，并准确称取1~25mg于离心管中； 

2）样本提取：加入300~500μL 75%的甲醇溶液并超声1~10min，然后加入500~2000μL的MTBE并振荡0.25~2h，然后加入150~350μL的水并振荡1~5min，静置5~20min后高速离心，溶液分为上下两层； 

3）溶剂用量：75%甲醇溶液与MTBE的体积比例在1:5和1:2之间，水与MTBE的体积比例在在1:5和1:2之间；75%甲醇溶液、MTBE和水的用量可以根据组织样本用量进行成比例的缩放； 

4）提取液转移：定量吸取部分上层溶液置于新的离心管中；同时定量吸取部分上层和下层溶液置于另一新的离心管中进行混合，上层和下层混合的比例在3:1和1:1之间； 

5）提取液干燥：将离心管中的溶液在冷冻干燥机上进行冷冻干燥； 

6）提取物保存：提取物分析前置于-80°C冰箱保存； 

7）代谢组学分析：混合层提取物加入50~2000μL 20%~80%的甲醇或乙腈溶液；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标代谢组学分析； 

8）脂质组学分析：上层提取物加入50~4000μL乙腈、异丙醇和水的混合溶液（混合体积比例为65:30:5）；振荡1~5min后高速离心，吸取上清液进行基于液相色谱-质谱联用的靶标或非靶标脂质组学分析。 

9）实际样品应用：利用所建立的微量组织中代谢物组和脂质组同时提取分析的方法对实际样本（动物或人的肝脏、肌肉等组织及人体活组织检查样本）进行代谢组学和脂质组学分析。 

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：