[发明专利]利用单管巢式实时聚合酶链反应(PCR)的改良结核菌诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用单管巢式实时聚合酶链反应（PCR）的改良结核菌诊断方法，尤其是一种利用两组结核菌特殊引物的单管巢式PCR方法，本发明的方法诊断迅速，有利于特异且具有高敏感性的结核菌诊断。 

背景技术

一般来说，结核是呼吸道感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)而引发的感染性疾病中的一种，经预测全世界约有三分之一的人口感染了结核菌，依据世界卫生组织2010年统计，一年约有880万人成为新的结核患者，其中约有110万人死于结核。韩国国内的结核携病率虽呈减少趋势，但是结核患者中女性和儿童患者人数与日俱增，成为一大社会健康问题。为了降低这种结核的发病率及死亡率，结核治疗及管理显得非常重要，需要特异性敏感性的检测方法。 

在结核的检查室诊断方法中，主要采用抗酸染色法和抗酸分支杆菌培养检测法。通常使用的抗酸染色法价格低且可迅速出来结果，被广泛应用于结核检测，但是结核菌菌数必须达到5×10^3～4个，才能检测出来，与培养法相比，敏感性低，无法区别结核菌和非结核性抗酸菌。与此相比，培养法作为结核诊断的标准方法，只需有10^1～2个结核菌即可检测出结果，但是结核菌的特性上需要很长时间（四至八周），无法实现迅速检测。另外，利用咳痰作为检查对象进行检查时，很难检查出肺部以外的结核，对于不容易取得咳痰的患者、儿童和女性患者，以及结核和HIV交叉感染的患者来说，会有患者呼吸器官的干酪样坏死及抗酸菌数量减少等情况，导致不易诊断结核。 

为了更加迅速和精密地检测结核，开发出聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时聚合酶链反应(real-time PCR)等确认结核菌DNA的核酸扩增检测(nucleic acid amplification test,NAAT)。其中最典型的一种PCR就是对检体DNA的特异部位进行2³⁵个以上的增幅，以电泳确认，与染色法和培养法相比，可 在当天出来准确的检查结果，但是此方法需要熟练的操作，也会发生因DNA增幅产物对核酸诊断检查环境的污染，导致伪阳性结果。为了进行更便利更安全的检测，利用荧光染料标记的特异低核苷酸探测剂（oligonucleotide probe），对增幅产物进行实时确认的实时PCR被广泛应用于结核诊断。以实时PCR为本的常用化研究或试剂盒中，大部分以单管实时PCR进行诊断。 

但是在检体中存在较少数量结核菌的咳痰中，为了确认结核菌，使用AFB染色法，若要确认阳性，至少每1毫升的咳痰中须存在10⁵个以上的菌数方可。为了检测检体内少量存在的结核菌，需要敏感性更高的诊断方法。另外在结核患者中，肾脏结合患者使用小便作为检体，易于检测结核菌，但是其他情况则很难通过小便来检测出结核菌。对于肺结核的情况，从肺中分解出结核菌，核酸（cell-free nucleic acid）再通过血液循环系统进入肾脏，从小便中排出，因此可检测出从小便中排出的的结核菌DNA。但是从小便中排出的结核菌大部分被拦截在肾脏的丝球体网上，为了检测出小便中排出的结核菌，需检测无法被丝球体网拦截的小结核菌，约70kDa或100bp以下的核酸可从小便中检测到结核菌。 

用于增幅标记的IS6110，copy数为1～20copy，在诸多研究中，其中以IS6110为标记的PCR的敏感性最高。但是MTB complex染色序列与多个NTM类似，最近在MTB strain中，报道出不具有此遗传基因的菌株。因此在本发明中，除DNA标记外，以RNA为标记，对用于RNA polymerase的rpoB遗传基因，和MTB上所存在R)-1遗传基因进行编译的ESAT-6(6kDa early secreted antigenic target protein)遗传基因同时增幅，从而解决伪阳性和伪阴性的问题，从而制造出高敏感性和特异性的实时PCR。 

PCR的应用法中，聚合酶链反应法是可以提高PCR增幅的特异性及敏感性的方法，多用于纯度较低的DNA或RNA的增幅上。此方法是对两种引物进行连续PCR的方法，利用目标遗传基因，进行1^st PCR，使用在第一PCR产物内边的第二引物，进行2^nd PCR。 

在本发明中，进行实时PCR时，使用两个遗传基因，将各遗传基因特异的两组引物放入同一管中进行增幅，利用单管巢式PCR，与现有的实时PCR相比，可提高特异性和敏感性，可在多种检体中进行结核诊断。