[发明专利]球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺

权利要求书

1.一种球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其特征在于，其步骤如下：

（1）选取培养至指数生长阶段的球等鞭金藻培养物，5000 rpm/ min下离心15 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，45℃下减压浓缩；冷冻干燥后，获得白色粉末状的胞外物质；

（2）取胞外物质，加入蒸馏水中，蒸馏水与胞外物质的质量比为15:1，混合均匀后，用0.5 M NaOH调节pH至9.0，在70℃水浴锅中提取240 min；提取结束后，5000 rpm/ min下离心5 min，取上清液加入质量浓度3% 的三氯乙酸，4℃下静置4 h后，5000 rpm/ min下离心5 min，弃去沉淀；上清液加入3倍体积无水乙醇，4℃下静置24 h，5000 rpm/ min下离心5 min，收集白色乳状沉淀；沉淀依次经丙酮、无水乙醇洗脱后，40℃下烘干，粉碎后，得白色粉末状物质即为球等鞭金藻胞外粗多糖ECPS；

（3）采用DEAE-52离子交换柱层析对球等鞭金藻胞外粗多糖进行分离，获得中性多糖ECPSⅠ和酸性多糖ECPSⅡ组分；

（4）采用Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分；其中，中性多糖组分经分离，得到3个组分，分别记为ECPSⅠ-A、ECPSⅠ-B和ECPSⅠ-C；酸性多糖组分经分离，得到5个组分，分别记为ECPSⅡ-A、ECPSⅡ-B、ECPSⅡ-C、ECPSⅡ-D和ECPSⅡ-E；

（5）富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSⅡ-A；经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析；洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPSⅢ。

2.根据权利要求1所述的球等鞭金藻胞外多糖的分离纯化工艺，其特征在于，所述的步骤（3）、（4）和（5）的具体操作如下：

（3）球等鞭金藻胞外粗多糖溶解后，加载于DEAE-52离子交换层析柱，依次用蒸馏水和1.0 mol/L NaOH进行洗脱，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，以硫酸-蒽酮法检测多糖，直至检测不出多糖组分，换用下一洗脱液；多糖组分合并收集后，用NaOH进行洗脱所收集的馏分先经透析后，再减压浓缩，分别获得中性多糖ECPSⅠ和酸性多糖ECPSⅡ组分；

（4）采用Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离纯化中性多糖和酸性多糖组分，以蒸馏水为洗脱液，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测；中性多糖组分ECPSⅠ经Sephadex G-100凝胶柱层析分离后，获得3个组分，分别记为ECPSⅠ-A、ECPSⅠ-B和ECPSⅠ-C；ECPSⅡ经Sephadex G-100凝胶柱层析进一步分离后，获得5个组分，分别记为ECPSⅡ-A、ECPSⅡ-B、ECPSⅡ-C、ECPSⅡ-D和ECPSⅡ-E；

（5）富集上述8个多糖组分中多糖组分量最大的ECPSⅡ-A，经多次富集，经减压浓缩后，将其加载于Sephadex G-100凝胶柱层析，用蒸馏水进行洗脱，每管收集3 mL，流速为1.5 mL/min，馏分采用硫酸-蒽酮法检测；洗脱后，获得单一多糖组分，经乙醇沉淀和冷冻干燥后，得到白色粉末状固体，为胞外纯多糖，记为ECPSⅢ。