[发明专利]特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP2E1属于CYP450家族中的CYP2E亚族，由CYP2E1基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的7%，主要代谢小分子物质。目前，已经确定为CYP2E1的底物有70多种，参与亚硝胺、异烟脐、四氯化碳、氯哇沙宗、醋氨酚、茶碱等化合物的代谢，CYP2E1可使这些药物转化为毒性更强的中间产物。

现有技术中，徐田雪将CYP2E1基因cDNA片段连接到了pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP2E1基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究。黄鹤将CYP2E1基因克隆到pYES2/CT载体上，导入酿酒酵母中，从而构建出能表达CYP2E1基因的酿酒酵母，该细胞也是可以用于体外研究药物代谢以及筛选药物，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP2E1基因的载体。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进人源肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。

本发明提供一种特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP2E1基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP2E1基因编码序列和EcoR I酶切位点，所述CYP2E1基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。

采用上述技术方案，本发明提供的CYP2E1基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。

作为本发明的进一步改进，所述CYP2E1基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2。采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP2E1基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中持续表达CYP2E1基因，减少了序列合成费用，成本较低。

相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP2E1基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A）  CYP2E1基因引物设计：根据CYP2E1基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’-ACCTCGAGTCATGTCTGCCCTCGGAGTCAC-3’，即SEQ ID NO：1作为上游引物，选取5’-ACGAATTCTCATGAGCGGGGAATGACA-3’，即SEQ ID NO：2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；