[发明专利]一种激活促红细胞生成素基因表达的方法

权利要求书

1.一种激活促红细胞生成素基因表达的方法，其特征在于，为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素基因的表达，包括以下步骤：

1）在促红细胞生成素基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；

2）靶点识别模块编码序列的构建：构建编码步骤1）所述靶点识别模块的双链DNA；

3）通过酶切连接的方法，将步骤2）制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；

4）重组质粒转染目的细胞，及目的细胞的培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述TALE靶点序列为促红细胞生成素基因启动子上游16～20个连续的碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述TALE靶点序列如SEQ ID NO：2所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为NI-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-NI-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQ ID NO：21所示。

6.如权利要求1-5任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤2）所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下：

A.构建单体库：所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；

B.按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2）所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下：

a 按照所述靶点识别模块的组成，将靶点识别模块由N端开始向C端方向，顺次按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式分组，构成个次模块；

b 构建单体库：所述单体库包括分别针对NI、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第1位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；每一次库中的M个单体从排序第1的单体开始，顺次以每n个单体作为一个分组，共获得个分组，并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的；四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；

c 按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，按照每n个单体一组的方式连接，构成个编码对应次模块的n联单体，然后再将个n联单体连接，或者将个n联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接，获得靶点识别模块编码序列；其中，M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目，n为整数，并且n的取值范围为2～6。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分组内n个单体顺次排列，同一次库的每一分组内排次第2至第n-1的任一单体，与同一次库的其他分组内排次第2至第n-1的任一单体，排次相同的单体的序列完全相同。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，每一所述分组内，排次第1单体的上游连接序列的5’端外侧与排次最后一位单体的下游连接序列的3’端外侧还分别各设有一成环序列，同一分组内的两个成环序列酶切后，获得互补的粘性末端。