[发明专利]人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及人白细胞介素-12(IL-12)的编码基因、真核宿主细胞和表达方法，具体而言，本发明涉及对人白细胞介素-12的编码基因进行优化，从而能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定高效表达。

背景技术

白细胞介素-12(IL-12)于1989年和1990由Trinchieri和Gately等发现，起初命名为NK细胞刺激因子(NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，1991年统一命名为白介素-12。

白细胞介素-12是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为35kDa(P35亚基)，另一条为40kDa(P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生，P35和P40单独存在时均无任何IL-12的生物活性。

IL-12具有调节和参与免疫应答细胞的活性，刺激NK细胞和T细胞产生干扰素-伽玛(IFN-γ)，促进Th1细胞的分化，是连接固有免疫和获得性免疫的核心因子。同时，

IL-12可促进造血功能的恢复，用于机体造血功能的降低导致的疾病，如急性放射病、放射性治疗、化学治疗等。另外，IL-12还具有抗肿瘤，抗病毒的效果，具有良好的临床应用前景。

在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。

以下表1列出了现有技术相关技术的培养条件和最高产量。

表1现有技术的培养条件和最高产量

如能提高rhIL-12的表达量，会推动rhIL-12的产业化。

但是，现有技术，都是对P35、P40如何插入载体能够促进表达进行探索，未从基因序列的优化方面考虑。忽视了目前医药蛋白药物的宿主细胞是非人源的细胞，如鼠源的细胞，例如最为广泛使用的中国仓鼠卵巢细胞(CHO，Chinese Hamster Ovary Cells)。人源IL-12的序列未必能最佳的利用鼠源细胞的蛋白表达系统。没有从基因序列的优化方面考虑。

虽然根据宿主细胞而优化待表达蛋白的基因序列的方法已有报道，例如，名称为“一种人白介素-10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌”的中国专利申请公开102268407A，但是其提供的是一种能高效表达于微生物的人白细胞介素-10基因序列。目前尚没有人尝试优化人白介素-12的序列，使之适宜在真核细胞，特别是CHO细胞中的表达，尤其是在无血清条件下的表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人白细胞介素-12的编码基因，其通过将人IL-12的基因序列优化而形成，适合在在真核细胞，特别是鼠源细胞(如CHO细胞)中表达，从而提高表达效率，增加蛋白的产量。

本发明的人白细胞介素-12的编码基因，包含

(a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO：10或其互补核苷酸序列；或者

(b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO：22或其互补核苷酸序列。

本发明的另一个目的在于提供一种表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其包含

(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：9或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：10或其互补核苷酸序列的第二表达载体；或者

(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：21或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：22或其互补核苷酸序列的第二表达载体。

本发明的又一个目的在于提供一种人白细胞介素-12的表达方法，其特征在于，所述方法包括

(a).分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：9或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO：10或其互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒；或者