[发明专利]重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组单纯疱疹病毒，特别是涉及一种在抗肿瘤活性及肿瘤靶向性上有所改进的单纯疱疹病毒。

背景技术

现有技术中已经提出单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)可用于溶瘤法治疗癌症，并通过剔除ICP34.5基因和ICP47基因对单纯疱疹病毒进行改进，使其可选择性地在肿瘤细胞内复制，而不伤害正常细胞，然而这种改进并不能有效地使单纯疱疹病毒特异性地只选择在肿瘤细胞内复制，而是也会有单纯疱疹病毒在某些正常细胞内复制，从而对这些正常细胞造成伤害。如何实现使单纯疱疹病毒特异性地只杀伤肿瘤细胞，而不破坏正常细胞一直是本领域技术人员研究的重点课题。

端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，其作用是维护染色体结构稳定，包括防止染色体末端融合，保护染色体结构基因和避免遗传信息在复制中丢失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白质组成的逆转录酶，能利用自身RNA为模板合成端粒DNA，弥补随细胞有丝分裂逐渐缩短的端粒。其有三个主要组成部分：人端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-as sociated protein，TP1/TLP1)、人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)。端粒酶RNA在大多数细胞中都表达，而人端粒酶逆转录酶是端粒酶的限速成分，仅在端粒酶阳性的细胞中表达，与端粒酶活性相关。尽管一些肿瘤细胞在重组时通过替代性端粒延长(alternative lengthening of telomeres，ALT)机制来维持端粒长度，但仍有85％以上的肿瘤细胞通过上调hTERT来活化端粒酶，而且hTERT仅在极少数正常体细胞中表达。这就为肿瘤治疗提供了一个很好的契机。单纯疱疹病毒表达的感染细胞蛋白(infected cell proteins，ICPs)分为三个等级：初始(immediate early，IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影响病毒复制的关键蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最关键的复制相关蛋白。

现已发现多种肿瘤特异性启动子。根据其特点，可分为以下几种：(1)泛肿瘤特异启动子，指在多种肿瘤细胞内发挥其功能的启动子，如hTERT启动子、存活素(survivin)启动子等。(2)组织特异性启动子，如前列腺特异性抗原(PSA)启动子。(3)某些肿瘤特有的启动子，如肝癌细胞特有的甲胎球蛋白(AFP)启动子、上皮细胞肿瘤的癌胚抗原(CEA)启动子等。这些肿瘤特异性启动子已广泛应用于肿瘤基因治疗及肿瘤诊断领域。

若将ICP4启动子替换为hTERT启动子(hTERTp)或其它肿瘤特异性启动子，使新重组单纯疱疹病毒只能在hTERT高表达的肿瘤细胞中表达其早期复制蛋白ICP4，从而进行复制增殖，杀伤肿瘤细胞，有望解决上述技术难题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种重组单纯疱疹病毒，该重组单纯疱疹病毒能选择性地在人肿瘤细胞内生长繁殖，而不在人正常细胞中繁殖，从而杀伤肿瘤细胞，且不伤害正常细胞。

本发明的另一目的在于，提供一种上述重组单纯疱疹病毒的制备方法。

本发明的再一目的在于，提供一种药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用，以及上述重组单纯疱疹病毒在制备治疗癌症的药物中的应用。

本发明的另一目的在于，提供另一种重组单纯疱疹病毒、其在制备诊断肿瘤的药物中的应用以及一种肿瘤诊断试剂盒。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的重组单纯疱疹病毒，其是将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp或其它肿瘤特异性启动子。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

前述的重组单纯疱疹病毒，其微生物保藏号为CGMCC No.6397。

前述的重组单纯疱疹病毒，其中该单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本发明提出的一种制备前述重组单纯疱疹病毒的方法，其包括以下步骤：用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：