[发明专利]一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产阿魏酸酯酶的微生物菌株，特别涉及一株绿木霉及利用该菌生产阿魏酸酯酶的方法。 

背景技术

阿魏酸酯酶也被称为肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一个亚类，也是一种胞外酶，它可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来。阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用，它可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间，木质素与半纤维素之间，半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。阿魏酸酯酶可以打开细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。 

在造纸工业中，经阿魏酸酯酶处理的原料，木质素更容易脱除，可减少制浆工序的化学药品用量。而纤维细胞壁经阿魏酸酯酶处理后，表面变得疏松，成纸时可以提高纸品的机械强度。利用阿魏酸酯酶处理纸浆后产生的阿魏酸可作为优质的抗氧化剂，除此之外，阿魏酸还具有的抗肿瘤、消炎、促进伤口愈等保健作用，所以阿魏酸可作为功能因子开发功能性的食品。同时，阿魏酸可以作为合成天然香兰素的前体，以阿魏酸为原料，利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相比具有毒性低，安全性高的特点，可以用作食品和化妆品行业的香料。 

专利CN200810056477.6公开了一种阿魏酸酯酶的提取方法，但操作较为复杂，关于阿魏酸酯酶的研究，有很多问题需要解决，主要是目前筛选出的分泌阿魏酸酯酶的微生物的分泌量仍然达不到工业化生产阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取方法有待改进，其工业化生产受到限制。 

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种利用绿色木霉（Trichoderma viride）通过液体发酵生产阿魏酸酯酶的方法，收率较现有文献报道提高了数倍，所采用的菌株代码为JBSH-OO1，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5612；该菌株可应用于生产阿魏酸酯酶，该方法发酵所得阿魏酸酯酶酶活可达200mU/ml以上,纯化后的阿魏酸酯酶酶活可达50000mU/g以上。 

本发明提供的具体技术方案是： 

首先获得了一株新的菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5612，其具体获得方法如下： 

（1）出发菌株：以本实验室收藏的各种菌株作为起始菌株，其中包括多种木腐菌、软腐菌、枯萎菌和其他霉菌，分类培养建立菌种库。 

（2）筛选方法：以阿魏酸甲酯作为唯一碳源制备平板培养基，接入上述菌 株在适宜条件下培养，根据是否产生透明圈进行一级筛分。初步筛选具有产阿魏酸酯酶能力的菌株，然后对初筛菌株进行摇瓶培养，根据液体培养物中阿魏酸酯酶的活性大小筛选出其中的2株产酶活性最高的菌株作为驯化菌株。 

（3）对2株待驯化菌株的生理生化特性、产酶性能等进行比较深入研究，最终筛选出一株产酶能力强、易于培养并具有稳定的传代特性的菌株，将其初步命名为JBSH01。 

（4）以该菌株为出发菌株，采用常规诱变方法，如UV，DMS，MMS，NTG等，结合低能离子注入法，反复多次诱变，复筛，最终获得了高产菌株JBSH-001。 

发明人对该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC No.5612，经检测其为存活状态。 

上述JBSH-001菌株，其形态特征如下： 

菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2-3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形。分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，绿色。在PDA培养基上菌落初为白絮状，后为暗绿色。上述形态特征与绿色木霉Trichoderma viride的培养特性一致。 

发明人同时对其进行了16S rDNA测序，其基因序列如Seq ID No:1所示，该序列为菌株JBSH-OO1的16S rDNA的全序列。 

用所测得的16S rDNA序列进行BLSTN比对，结果显示，菌株JBSH-OO1的16S rDNA的核苷酸序列与木霉属Trichoderma spp.不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，与其中明确标记为绿色木霉Trichoderma viride的5株菌株有100%的同源性，因而进一步确定本发明所提供的菌株为一株绿色木霉菌株。