[发明专利]BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及脑胶质瘤治疗领域，具体涉及一种BMP2/7缓释系统在脑胶质瘤治疗上的应用。

背景技术

脑肿瘤的发病率为21/10万人，约占人类所有癌症的2％，其中脑胶质瘤的发病率约占脑肿瘤的60％。在1996年第三届(悉尼)国际肿瘤控制大会总结的资料中统计，脑胶质瘤的发病率为3～10/10万，占全身恶性肿瘤的1％～3％，我国每年新发脑瘤病人大约有4万人。手术加放化疗的平均生存期仅为8～11个月至今我国还没有脑胶质瘤大宗病例的长期追踪随访资料。由于脑胶质瘤的恶性程度高，转移快，复发率高，致残致死率高，目前缺乏有效的治疗手段。因此急待一种切实可行的治疗方法。

目前国内外尚没有治疗脑胶质瘤的有效手段，基本以外科手术与化疗为主，但效果不理想，复发率高。其中化疗的的毒副作用大，病人反应强烈。本研究拟采用的BMP2/7诱导脑胶质瘤干细胞分化的方法是一种无毒的治疗手段，在不增加病人痛苦的前提下，能够有效缓解病人的痛苦，因此具有很高的临床价值。

本专利发明人采用柔性连接技术自行研制开发的BMP2/7的异源二聚体结构类似物与同类其它BMPs药物相比，具有超群的生物活性，与胶原海绵复合后构成新型的BMP缓释系统，能够明显增加局部的药物浓度，提高药效水平。将该缓释系统植入脑组织，可以解决脑胶质瘤治疗时药物难以通过血脑屏障以及局部药物浓度较低的困难，提高药物的作用时间。同时，副反应小，毒性低，将成为良好的新型抗胶质瘤药物。

采用柔性连接技术表达BMP-2/7异源二聚体结构类似物：

1990年，Sampath等人从牛脱矿骨粉分离到一种蛋白，分子量约30,000左右，体内与体外都有明显的骨生成作用。还原型SDS-PAGE电泳则发现该蛋白由两个亚基组成，分别为18,000与16,000左右，经脱糖基处理后，分子量为16,000与14,000，测序后发现前者为BMP-7，后者为BMP-2，均为糖蛋白，但糖基化对二者的活性没有影响。表明天然状况下，就有BMP-2/7异源二聚体的存在。此后，获得BMP-2专利的Genetics Institute公司的研究人员发现，BMP-2/7异源二聚体的活性明显高于BMP-2与BMP-7的同源二聚体，体外实验的结果为20倍左右，体内实验为5-10倍。Wang等人发现，天然组织提取的BMP的诱骨活性比rhBMP2高10倍。Aki Aono等人的研究表明BMP-4/7异源二聚体也具有相同的情况，并猜测体内组织中BMP主要以异源二聚体的形式存在。虽然这一现象尚缺乏明确的理论依据，但许多研究者已将目标集中在此方面的工作上。

根据以上的结果，本专利发明人通过基因重组的方式将BMP-2与BMP-7的碳端用一段柔性肽(GlyGlyGlyGlySer)₄串连起来，并在Pichia Pastoris中得到异源二聚体的高效表达。柔性肽只有Gly与Ser两种氨基酸，因为侧链基团影响小，所以肽键的刚性很小，可以自由旋转，有极强的柔顺性，不会阻碍两侧肽链的自由折叠，又称柔性连接技术，运用很广。目前十分流行的人源化单抗ScFv，即是通过柔性肽的方式获得表达的。好处表现在下述方面：

1.提高异源二聚体的产量：与共表达BMP-2和BMP-7，在内质网中正确折叠，分泌到培养基中进行随机配对形成二聚体的方法相比，将二者用一段柔性肽共价连接起来表达可以得到均一型的异源二聚体，减少同源二聚体杂质，提高了产率，降低了纯化成本。

2.提高重组蛋白的可溶性：BMP单体有较多的疏水性氨基酸，但由于缺乏一个疏水中心，而将疏水集团暴露在单体分子表面，因此分子之间特别容易聚集，形成沉淀。将二者共价串连，可以减少单体之间的空间距离，使得二聚体更易发生，可溶性增加。

3.有利于正确构象的形成：活性形式的异源二聚体具有七对二硫键，其中一个是在分子之间形成的。串连起来的单体由于分子间的距离更加接近，更利于分子间二硫键的形成。

4.活性有所提高：由于BMP-2与BMP-7的协同作用，异源二聚体的比活比同源二聚体提高十几倍。

5.具有自主知识产权：这种新型的BMP由三部分组成，BMP-2、7和一段柔性肽，共同组成了一个完整的分子，我们把它叫做结构类似物，是一种有别于BMP2/7的新型分子，国内外均无报道。因此不会有知识产权的纠纷。

应用共价结合肝素的胶原作为BMP的载体，这种设计方案国内外均未见报道：