[发明专利]贪噬菌CGMCC 4969的酰胺酶基因及其在生物降解丙烯酰胺中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969 产生的酰胺酶基因应用于丙烯酰胺生物降解。

背景技术

丙烯酰胺广泛应用于石油开采、农业和化工业中，丙烯酰胺的聚合物聚丙烯酰胺作为驱油剂用于提高石油开采回收率；作为絮凝剂用于造纸工业、工厂废水处理及下水处理；用作土壤改良剂，可使土壤团粒化，改善空气流通性、水渗透性和保水性。工农业中大量使用丙烯酰胺造成土壤和水环境污染。由于丙烯酰胺是一种神经毒剂和致癌物，消除丙烯酰胺的污染有助于改善环境，降低其生态环境的潜在风险。

微生物降解被认为是最为有效的有机污染物的降解方法之一。微生物产生的酰胺酶(amidase，EC.3.5.1. 4)可将酰胺化合物水解生成相应的酸并释放氨。目前节杆菌Arthrobacter sp.J1、芽孢杆菌Bacillus sphaericu、假单胞菌Pseudomonas putrefaciens、红球菌Rhodococcus sp.、诺卡氏菌Nocardia rhodochrous，沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris，产气肠杆菌Enterobacter aerogenes等可降解丙烯酰胺，然而未见有贪噬菌降解丙烯酰胺的报道（Buranasilp K, Charoenpanich J, 2011. Biodegradation of acrylamide by Enterobacter aerogenes isolated from wastewater in Thailand. Journal of Environmental Sciences, 23 (3): 396–403）。

申请人筛选到一株降解农药噻虫啉的贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969菌株，已在申请号为2011102159822的中国专利申请中公开；在应用方面该申请仅公开了贪噬菌V.boronicumulans CGMCC 4969在生物转化3-氰基吡啶生成烟酰胺中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供贪噬菌（V.boronicumulans）CGMCC 4969的一种新用途，该菌能产生酰胺酶，进而可在生物降解丙烯酰胺中应用；以及从该菌株中克隆酰胺酶基因并在E. coli Rosetta中诱导表达，重组表达菌株在降解丙烯酰胺中的应用。

申请人从贪噬菌（V.boronicumulans ）CGMCC 4969菌株中克隆到了一个酰胺酶基因，其碱基由序列表中SEQ ID No：1组成。将酰胺酶基因重组于pET28a质粒上，重组质粒pET28a-amidase电转化至E. coli Rosetta菌株中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，含表达酰胺酶的E. coli Rosetta 菌株可降解丙烯酰胺，而不含酰胺酶基因的对照菌株不能降解丙烯酰胺。

本发明提供了V. boronicumulans CGMCC 4969菌株在生物降解丙烯酰胺中的应用，其降解丙烯酰胺的HPLC结果如图1所示，降解曲线如图2所示。

从V.boronicumulans CGMCC 4969菌株中克隆出的酰胺酶基因，其序列如SEQ ID No：1所示。该基因由1038个碱基组成。

上述所说的应用是将由SEQ ID No：1组成的DNA序列插入到重组表达质粒pET28a中，得到重组质粒pET28a-amidase，pET28a-amidase质粒电转化至大肠杆菌E. coli Rosetta菌株中，经IPTG诱导，宿主菌表达酰胺酶（图3），含表达蛋白的E. coli Rosetta细胞用于生物降解丙烯酰胺。

本发明实验表明重组V. boronicumulans CGMCC 4969的酰胺酶基因的大肠杆菌细胞可降解丙烯酰胺（如图4所示）；而不含重组酰胺酶的E. coli Rosetta pET28a不降解丙烯酰胺。

附图说明

图1：V. boronicumulans CGMCC 4969降解丙烯酰胺生成丙烯酸的HPLC图。