[发明专利]质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒

说明书

【相关申请的交叉引用】

本申请基于2011年8月25日提交的在先日本专利申请No.2011-183896，并要求其优先权，其全部内容通过引用并入本文。

【技术领域】

本实施方式涉及质粒型载体、基因启动子活性的检测方法、及分析试剂盒。

【背景技术】

人基因组的碱基序列被确定以来，以基因组信息作为基础的疾病的新的诊断法的开发被期待。例如，由基于基因组的碱基序列信息的基因解析，发现了以癌为首的多种疾病关联基因。这些的疾病关联基因或疾病关联蛋白质作为癌等的疾病的诊断用生物标记物（bio-marker）而被关注。但是，由生物标记物检测的诊断由于在疾病的早期得不到必然充分的生物标记物的表达等的原因，得不到稳定的结果是现状。

疾病的早期诊断，即便从治愈率的升高或患者的负担轻减的方面来看，也对今后的医疗不可或缺。作为早期诊断的一种方法，可举出检测在疾病的早期表达的基因的启动子活性的变化的方法。通过基因启动子的活性变化，基因的表达概率被控制。基因启动子的活性相比疾病关联基因或疾病关联蛋白质的表达更早期被观察到。

作为检测细胞内的基因启动子的活性的方法，可举出报告子基因分析（reporter gene assay）。报告子基因分析是将连结用于可视化启动子的活性的报告子基因的表达盒整合到所述启动子之下游的报告子载体导入被检细胞而基于报告子蛋白质的活性定量化所述启动子的活性的方法。作为报告子基因，采用萤光素酶基因或β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白质基因等。

但是，例如，在疾病早期，基因启动子的活性变化而处于前疾病化的状态的细胞是极其少数。为诊断采集的血液或组织中含所述细胞的概率说不上高。因此，需求在疾病的早期诊断等，高灵敏度的检测技术。

现在，作为高灵敏度的报告子基因分析，报告了由基因启动子和荧光蛋白质整合到病毒（virus）的基因组的病毒型报告子载体的方法。在此报告子基因分析中，通过在感染病毒载体的宿主细胞之内部增殖所述病毒载体，增加荧光蛋白质的表达量，使报告子基因分析高灵敏度化。但是，病毒型报告子载体在向宿主细胞的所述载体的导入中利用病毒的感染能力。因此，有病毒型报告子载体感染操作者的危险性。从而，病毒型报告子载体的操作不简便，安全性成为课题。

另一方面，质粒型报告子载体相比病毒型报告子载体更操作简便，并且也不具有感染性而安全性高。使用质粒型报告子载体的报告子基因分析也有很多报告。期待向疾病的早期诊断的质粒型报告子载体的适用。但是，质粒型载体与病毒型报告子载体不同，在宿主细胞之内部不增殖，因此其检测灵敏度有问题。

【现有技术文献】

【非专利文献1】KojimaT.、JCL、2009年、第119卷、p3172-81

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

实施方式的目的是提供可以高灵敏度检测基因启动子的活性的质粒型载体、基因启动子的检测方法、及分析试剂盒。

【解决课题的技术方案】

本实施方式中涉及的质粒型载体具备：基因启动子；以及第1基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的，用于可视化上述基因启动子的活性的报告子蛋白质；以及第2基因，其编码配置在上述基因启动子之下游的复制起始蛋白质；以及内部核糖体结合序列，其配置在上述第1基因和上述第2基因之间；以及转录终止信号序列，其编码用于终止上述第1基因和上述第2基因的转录的信号；以及复制起始序列，其被上述复制起始蛋白质识别。

【发明效果】

以高灵敏度检测基因启动子的活性。

【附图说明】

图1是示本实施方式中涉及的质粒型载体的结构的模式图。

图2是示使用图1的质粒型载体的，基因启动子活性的检测方法（报告子基因分析）的全过程的图。

图3是示本实施方式中涉及的质粒型载体pCMV-Luc-IRES-LT的制备方法的典型流程的模式图。

图4A是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT的结构的模式图。

图4B是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-E107K的结构的模式图。

图4C是示本实施方式的实施例中涉及的pCMV-Luc-IRES-LT-D402E的结构的模式图。

图5是示本实施方式中涉及的阴性对照用的载体pCMV-Luc的制备方法的典型流程的模式图。