[发明专利]一种肝素钠中多硫酸软骨素的高灵敏度检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物制药领域，特别涉及一种肝素钠中多硫酸软骨素的高灵敏度检测方法。 

背景技术

    肝素是一种来源于猪肠黏膜的硫酸化糖胺聚糖，具有抗凝血活性，在心血管疾病的防治方面具有广泛用途。据中国医药信息网报道，2006年肝素类药物的年销售额在30亿美元以上。肝素是我国最重要的生化原料药出口品种之一，据中国医药保健品进出口商会统计，2005年我国肝素及肝素类产品出口数量为96.97吨，同比增长49％，出口额为7527.32万美元，同比增长了54％。我国肝素共出口到36个国家和地区，主要出口市场是美国、德国、法国、意大利和印度，所占世界肝素原料药贸易份额高达87％。2008年，在“肝素钠污染事件”的影响下，我国肝素钠行业曾面临严重信誉危机，出口量一度急剧萎缩。经专家分析，上述事故原因在于肝素钠中含有多硫酸软骨素（OSCS），该杂质增加了患者用药时产生大出血的风险，因此控制多硫酸软骨素对于提升肝素产品质量至关重要。随着心脑血管疾病患者的增多，肝素的需求量仍将进一步增加，该产品市场发展潜力巨大，加强对肝素钠中多硫酸软骨素的检测控制，对于提升我国肝素钠产品的市场竞争力具有重要意义。 

目前，国内肝素钠行业对多硫酸软骨素进行检测的方法主要有核磁共振法、醋酸纤维素薄膜电泳法，上述两种方法存在检测灵敏度不高的问题，无法从根本上杜绝多硫酸软骨素污染。专利CN101825607所报道琼脂糖凝胶电泳检测法，对OSCS检测限为0.5%左右，存在操作繁琐、电泳板质量参差不齐、重现性差等缺点，仍不利于对多硫酸软骨素进行质量控制。美国药典对多硫酸软骨素采用强阴离子交换高效液相色谱法（SAX-HPLC）进行控制，检测限达到0.1%，检测灵敏度仍有待提高。 

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种采用高效毛细管电泳法（HPCE）的肝素钠中多硫酸软骨素的高灵敏度检测方法，该法检测灵敏度高、操作简单，OSCS的检测限达到0.04%。 

本发明的技术方案是包括以下步骤： 

1）样品液的配制：称取肝素钠样品，精密称定，精确至0.0001g，加入到10ml容量瓶中，用纯化水充分溶解后，加纯化水稀释至刻度； 

2）标准品溶液的配制：分别用纯化水将系统适用性标准品、肝素钠鉴别标准品和多硫酸软骨素标准品溶成浓度为20-60 mg/mL的溶液；

3）缓冲溶液的配制：在容量瓶中配制一定浓度的磷酸盐缓冲液或一定浓度的磷酸锂缓冲液；

4）选择总长度25-40cm，内径为20-40μm的熔融石英毛细管，在磷酸盐缓冲液中，对肝素钠系统适应性标准品和肝素钠鉴别标准品进行进样分析，样品浓度为30-50mg/ml，肝素钠系统适应性标准品的肝素钠峰和多硫酸软骨素峰可完全分离，分离度＞4.0%，该条件下待测产品中不得含有多硫酸软骨素峰，检测灵敏限低于0.1%。

上述的样品浓度为50mg/ml。 

上述的磷酸钠缓冲液或磷酸锂缓冲液，其pH值范围为2.0-3.0，磷酸盐缓冲液的浓度是300mM-1M，磷酸锂缓冲液的浓度为600mM-1M。 

本发明的进一步优化方案为，所述的磷酸盐缓冲液为浓度为600mM的磷酸锂缓冲液，使用的毛细管柱为毛细管柱型号为总长度30.8cm（有效长度为20.5cm），内径为25μm的熔融石英毛细管，样品浓度为样品浓度为50mg/ml，多硫酸软骨素峰和肝素钠峰能实现很好的分离，检测限为0.04%。 

本发明与现有技术相比具有以下显著优点： 

（1）本发明所公开的高效毛细管电泳检测多硫酸软骨素的方法的检测限可以达到0.04%，该法可有效控制肝素钠中的多硫酸软骨素，有利于进一步提升肝素钠产品质量，避免肝素钠污染事件的再次发生；

（2）本方法检测灵敏度高，检测时间短，操作简便，重现性好，可随时对多硫酸软骨素杂质进行跟踪检测，适用于大规模生产中的质量控制。

附图说明

附图1是本发明的高效毛细管电泳法专属性与检测限评价及样品多硫酸软骨素检测结果图。 

具体实施方式

结合附图，对本发明作进一步的描述： 

本发明技术方案是包括以下步骤：

1）分析条件及仪器的选择