[发明专利]矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物种质资源的超低温保存方法，具体地说，涉及一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法。

背景技术

矮牵牛（Petunia×hybrida Vilm.），别名灵芝牡丹、碧冬茄、撞羽朝颜等，为茄科（Solanaceae）矮牵牛属花卉。矮牵牛为多年生草本双子叶植物，常作一、二年生栽培，株高15~80cm不等；叶片呈现椭圆或卵圆状；营养生长期短，当年可开花，花期可长达数月之久；花冠呈现喇叭状（类似牵牛花）；花瓣边缘类型有平瓣、波状瓣、锯齿瓣等；花色有紫、红、白、粉及镶嵌、网纹、条纹等；果实为尖圆形蒴果，种子极小，千粒重约0.1g（费砚良,刘青林,葛红等.中国作物及其野生近缘植物,花卉卷[M].中国农业出版社,2008:505-508）。

矮牵牛原产于南美洲的阿根廷，目前在世界各国均广泛种植，如日本、意大利、法国、西班牙、荷兰和德国等，用于道路街边绿化和庭园美化；在美国，矮牵牛的种植面积和消费额高居草本花卉之首；在日本，矮牵牛也被评为最受欢迎的草本花卉之一。矮牵牛广泛应用于花坛、花境布置，窗台和庭院装点，另外大花、重瓣的品种也是切花的材料。

矮牵牛种子常规保存寿命3-5年，发芽率60%左右，染色体倍数为2X、4X、5X（X=7）类型。矮牵牛品种在种植时退化现象严重，很多品种只能通过无性繁殖保存种质。我国目前矮牵牛种子多为国外进口的杂交种，其价格十分高昂，虽可以采用扦插繁殖，但其成活率低，但是实际生产中需要大量的种苗，很难在短时间内提供大量的繁殖体。

目前，有关矮牵牛的种质保存方面的研究报道较少。超低温保存技术是可长期安全保存种质资源的可选择的较佳途径之一，不但节约空间，而且成本低。现已开发出多种超低温保存方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同栽培品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同，迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的一个主要瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及植株再生培养方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低温保存技术，包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温（-196℃）冷冻保存的步骤。

材料扩繁具体步骤如下：1）将矮牵牛试管苗接种在含0.5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固体培养基上进行扩繁；2）将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2℃，光照14h/d，光照强度为700lux。

茎尖剥取具体为：在无菌条件下，从继代15-20d的生长健壮的矮牵牛无菌苗上剥取带2-3片叶原基，直径大小约2~3mm的离体茎尖为材料。

预培养具体为：将剥取的茎尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25℃振荡预培养1~3d，摇床转速为60rpm/min。

装载具体为：将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载20~40min；所述装载液的组成为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

PVS2脱水处理具体为：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃处理30~50min；所述PVS2的组成为：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。

超低温冷冻保存具体为：将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。

本发明进一步提供利用上述方法获得的矮牵牛离体茎尖在组织培养及植株再生中的应用。其包括：解冻、洗涤及恢复再生培养的步骤。具体为：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，迅速投入卸载液中解冻并洗涤，然后将茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2℃下暗培养7d，最后移至光下培养。洗涤次数优选为2~3次，每10min更换一次卸载液。

所述卸载液的组成为：MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢复再生培养基的组成为：MS+0.5mg/L BA+30g/L蔗糖+9.0g/L琼脂。

本发明的矮牵牛试管苗离体茎尖小滴玻璃化法超低温保存及植株再生培养方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存矮牵牛种质资源的方法，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达50％以上。

附图说明