[发明专利]重组促红细胞生成素及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组促红细胞生成素及制备方法，具体涉及化学修饰的重组促红细胞生成素及制备方法。

背景技术

促红细胞生成素(Erythropoietin)也称促红素，英文简称EPO，是一种糖蛋白激素，其主要的生理功能是刺激骨髓红细胞前体细胞的分化与增殖，因此EPO被认为是促进红细胞的产生并能够调节体内的红细胞总量在最适宜水平的主要调节因子。

天然人促红细胞生成素(hEPO)是一种主要由肾脏合成并分泌的糖蛋白激素。当肾脏功能衰竭时，EPO就无法正常合成，因而导致红细胞生成数量的减少，即造成贫血。贫血是慢性肾病的常见症状之一，以前对于慢性肾病引起的贫血没有有效的预防和治疗措施，基本上只能是通过输血来暂时缓解症状。

随着现代基因技术的发展，1984年重组人促红素(r-HuEPO)首次研究成功并广泛应用于临床，大大加速了人们对促红素的基础及应用研究，并为肾性贫血病患者提供了新的医疗途径。现有的研究表明促红素的作用要比以前所认识到的广泛，它不仅适用于慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血和艾滋病引起的贫血等，还可以降低病人对输血的需求，减少艾滋病以及病毒性肝炎等通过血液制品传播疾病的发生几率。目前，越来越多得贫血患者在接受EPO治疗。

目前医药市场上的促红素产品以第一代重组促红素为主，主要在中华豚鼠细胞内表达和然后纯化。而第一代重组促红素，因其血浆半衰期较短以及对蛋白酶降解的敏感性，其在体内的生物利用度较低。针对第一代产品的缺陷，目前已经开发出第二代重组促红素产品(以罗氏制药(Roche)开发出来的CERA为代表)，即经聚乙二醇(PEG)修饰的重组促红素。

聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物常被运用到治疗和诊断有重大意义的多肽的共价修饰上。例如PEG共价连接到白介素、干扰素等治疗性多肽上，已经报道PEG的共价修饰可以延长这些治疗性多肽在体内的半衰期、和/或降低它们的免疫原性和抗原性。

同样的，PEG的共价修饰也适用于重组促红素。临床实验也证明了，将无体内活性或生物利用度较低的重组促红素经聚乙二醇共价修饰，可以获得具有体内促红细胞生产活性的重组促红素产品，该产品的半衰期是第一代重组促红素产品的16倍以上。

除了PEG以外，其他的聚环氧烷(非抗原性水溶性聚合物)也能用于修饰重组促红素，起到延长血浆半衰期的作用。

到目前为止，已经公开了重组促红素的多种类型的聚乙二醇化学修饰方法，例如WO94/28024公开了一种具有促红细胞生成素活性的糖修饰的PEG缀合物，其中PEG与rEPO的被氧化的糖链连接，在PEG化学修饰方法中，A)若只是采用纯化学的方法缀合到PEG上(例如罗氏制药的CERA是通过对重组促红素内的自由氨基进行PEG化学修饰)，这类方法通常都存在选择性差(无法定向和/或特异性修饰)，以及反应条件恶劣等缺陷；B)采用PEG对重组促红素的被氧化的糖基进行共价修饰，由于共价修饰前涉及到糖基化以及糖基氧化的步骤，这类方法同样存在选择性差、反应不完全的缺陷。