[发明专利]鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白的制备方法，还涉及一种表达saGH-TAT重组融合蛋白的基因工程菌，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白在促进鱼类生长中的应用。

背景技术

生长激素（Growth Hormone,GH）是一类由中腺垂体细胞分泌的单链肽类素，本质是蛋白质。GH广泛存在于脊椎动物（哺乳纲，鸟纲，爬行纲，鱼纲等）中,在多种重要的内分泌调控活动中起着重要的作用，尤其表现在促进鱼体快速生长上，由于在鱼类养殖业上的广泛前景，因而从其被发现开始一直成为研究的热点。

大量生长激素可以通过重组生长激素基因工程菌发酵而获得。鱼类生长激素基因在大肠杆菌中的表达，最早是由Sakine在1985年完成的，诱导表达的生长激素蛋白产物占细胞总蛋白的15%。随后，虹鳟、鲑、罗非鱼等的生长激素也在大肠杆菌中相继获得表达。

有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展：其一是表达效率的提高，根据大肠杆菌偏爱密码子和已知的草鱼生长激素氨基酸序列，人工合成草鱼生长激素cDNA，并构建表达载体pET-GH，转化BL21(DE3)，在T7启动子的驱动下，通过诱导，获得的草鱼生长激素表达量占细胞总蛋白量的40%其二是采用可作为饵料的表达系统Kawata等构建另一类表达载体pQSG1,在藻类（Agmenellum quadruplicatum）中表达重组的鲑鱼生长激素，表达量占细胞蛋白含量的0.1%。Tsai构建了重组金枪鱼生长激素cDNA的杆状病毒载体pHM，在多聚角蛋白启动子的调控下，在昆虫细胞内表达，表达量占细胞总蛋白的2%-8%新型表达载体的研制和应用，可以获得更高表达量的外源蛋白。

酵母是单细胞低等真核生物，它不仅具备原核细胞增殖快、易培养、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能和重组蛋白正确折叠的细胞内环境，加之酵母粉本身就是非常好的单细胞蛋白饵料添加剂，富含各种必需的氨基酸、维生素。因此，以酵母作为生长激素的表达宿主菌，在生产中更具有价值!啤酒酵母首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，但在大量表达外源蛋白时，性状不够稳定，质粒易于丢失，不适合高密度培养。甲醇营养性酵母（Pichia pastoris），又称毕赤酵母，可利用烷烃类化合物来生产单细胞蛋白，成熟的大规模发酵技术已经建立。

生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收大分子并转移进入血液循环。给虹鳟投喂重组鲑鱼生长激素，虹鳟的体重和体长明显高于对照。通过荧光标记生长激素进一步确证，虹鳟的后肠是吸收生长激素的部位。在生长激素通过胃和肠道前部时，其中大部分被降解，余下的小部分到达后肠并进入血液循环。当生长激素以抗酸多聚物包被后投喂鱼，鱼体血液中的生长激素水平以及鱼的生长速度都明显提高。鲤科鱼类与鲑科鱼类不同的是没有胃，灌喂不同鱼同样浓度的辣根过氧化物酶，发现鲤鱼血浆中的辣根过氧化物酶是虹鳟血浆的1000倍。所以生长激素在投喂给鲤科鱼类时，可以有更多的生长激素蛋白分子到达后肠而被吸收。

近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域（protein transduction domains,PTD）。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的转录激活因子（Trans-activating transcriptional activator,Tat）。Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。