[发明专利]固定化漆酶微球载体及其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于及环境监测领域，涉及一种固定化酶微球载体及其制备方法与应用。

背景技术

漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，广泛存在于植物、真菌甚至昆虫体内。漆酶具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性，能催化许多酚类、芳香胺类物质、羧酸类、甾体激素和生物色素、金属有机化学物等，且反应产物是水，绿色、环保。因而在废水处理、纸浆漂白、生物传感器和生物监测等方面具有较大的应用潜力。但是漆酶存在价格较高，易受各种环境因素的干扰变性失活，不可重复利用等缺点。

漆酶的固定化可以实现漆酶的重复性使用和稳定性使用。固定化漆酶主要有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法四种方法：1）吸附法固定漆酶具有吸附条件温和、简便，成本低，载体可反复使用的优点。但是这种方法固定的漆酶存在对离子强度、pH、温度等因子敏感的缺点。2）载体与漆酶共价偶联的方法有很多，且固定化的漆酶非常稳定，损漏少。但是偶联试剂对漆酶有一定毒性，易引起漆酶失效，成本较高。3）交联法可用的交联试剂多，技术简易；稳定性较高。但是交联条件较激烈，常出现扩散限制，使用有一定难度。4）包埋法可进行大量的固定化，并可做成任意大小。缺点是仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，反应常受扩散限制。

近年来，不同类型载体固定化漆酶的方法和应用成为研究热点。国内外常采用的固定化载体包括壳聚糖、硅胶、活性炭、高分子滤膜、电纺纤维等材料。但现有的酶固定化材料不同程度存在酶的固定化效率低、可分离性差、操作工艺复杂、成本较高等问题。如此硅胶活性炭等材料作为载体，存在与水分离、亲水表面与酶链接不紧密等问题；而高分子滤膜、壳聚糖、电纺纤维等存在生物相容性不好、机械强度差、且操作过程复杂等问题。目前，各种漆酶检测仪反应器中的固定化酶载体大多为玻璃珠微球等无机载体。然而，玻璃珠表面功能化比较困难，且生物相容性不好。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化酶微球载体及其制备方法与应用。

本发明提供的制备固定化漆酶载体的方法，包括如下步骤：将聚乙烯醇微球进行磷酸化改性，得到所述固定化漆酶载体。

上述方法中，所述聚乙烯醇微球的粒径为10-1000μm；

所述聚乙烯醇微球的制备方法为反相悬浮交联法。

所述反相悬浮交联法包括如下步骤：将聚乙烯醇和水于沸水浴中混匀至溶解，冷却至30-80°C后再加入液体石蜡，室温搅拌后再加入酸溶液和戊二醛的水溶液搅拌离心分离后得到所述聚乙烯醇微球；

所述聚乙烯醇、水和液体石蜡的用量比为1g：7.5-15mL：15-50mL，优选1g：10mL：20mL；

所述室温搅拌步骤中，转速为200-2000rpm，优选500rpm；搅拌桨半径为2cm；时间为0.5-24小时，优选2小时；

所述酸溶液的浓度为0.1-1mol/L，优选1mol/L；所述戊二醛的水溶液的质量百分浓度为10-100%，优选50%；

所述搅拌离心分离的搅拌步骤中，转速为200-2000rpm，优选500rpm；搅拌桨半径为2cm；时间为10-60分钟，优选30分钟；所述离心分离步骤中，转速为1000-10000rpm，优选4000rpm，离心机半径为13.5cm。

上述固定化漆酶载体的方法中，所述磷酸化改性步骤包括：将所述聚乙烯醇微球浸于溶质为磷酸水溶液和脲、溶剂为水的溶液中，水洗至中性。

所述磷酸水溶液的质量百分浓度为80-98%；

所述聚乙烯醇微球、磷酸水溶液、脲和水的用量比为1g：5-50mL：1-10g：0.1-10L，优选1g：10mL：3g：1L；

所述浸泡步骤中，时间为10-3000分钟，优选30分钟。

按照上述方法制备得到的固定化漆酶载体，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种固定化漆酶的方法，该方法，包括如下步骤：将前述本发明提供的固定化漆酶载体、漆酶与缓冲溶液混合静置。

该方法中，所述缓冲溶液的pH值为2-8，优选4.5；所述缓冲溶液选自乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠–柠檬酸和柠檬酸–柠檬酸钠中的至少一种；

所述静置步骤中，时间为1-48小时，优选24小时。

按照上述方法得到的固定化的漆酶及所述固定化的漆酶在环境监测或废水处理中的应用，也属于本发明的保护范围。

上述本发明提供的制备固定化漆酶载体和固定化漆酶的反应方程式如图1所示：

1.反相悬浮交联法制备聚乙烯醇微球及磷酸化方法（图1a）