[发明专利]一种烤烟烟叶中微生物的富集与纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烤烟烟叶中微生物的富集与纯化方法，属于微生物学领域的微生物细胞的分离、提取与纯化方法。

背景技术

烤烟烟叶中目前已探明的化学成分己达5500余种，包括多糖、蛋白质和烟碱等，其中绝大部分是微生物活动需要的营养物质。这些物质具有亲水性，易从空气中吸收水分，为微生物活动提供必要的水分条件。烟叶经过初烤、仓储、复烤、自然醇化、卷烟配方、卷烟制丝、烟支制卷、卷烟包装等生产工艺流程，表面和内部和寄附了大量微生物。由于烟叶吸湿性强，而且含有微生物生长所需要的各种营养物质，一旦条件适宜，烟叶极易滋生各种微生物，分解烟叶中的有机物质。

在烤烟型卷烟生产中，烟草叶面微生物的活动对烟叶初烤、仓储、复烤、自然醇化产生极其重要的影响。因此，自19世纪50年代中叶人们就开始对微生物在烟草中的作用进行研究，至今已取得了大量的研究成果，其中涉及最多的是有害微生物的控制与有益微生物利用研究。尤其是利用研究，现今仍是一个热门的研究课题。

以往对烟草叶面微生物的主要研究采用传统的纯培养方法，而烟叶微生物生态群落是一个非常复杂的生物体系，有着巨大的基因资源以及丰富的生态资源。自然界能够分离培养的微生物不到1％，绝大部分微生物是不可培养或未培养的微生物。现阶段所开展的以基础微生物研究方法对烟叶微生物进行分离培养的微生物区系研究，对烟叶微生物群落的认识主要基于实验室纯培养的单一微生物物种，对微生物群落作为整体的性能认识是不足或片面的，不能揭示其余大量的微生物，以至对烟叶中微生物的多样性认识以偏概全。

近年来，通过直接对样品的DNA分析揭示其微生物种类的技术得到了较大发展，已建立起了许多不需要对微生物进行独立培养的新方法和新技术。如变性梯度凝胶电泳DGGE法、机扩增多态性DNA技术RAPD和限制片段长度多态性RFLP等。宏基因组学技术是近来发展比较迅速的一种新方法。这种方法从环境样品中直接提取微生物基因组DNA(宏基因组)并克隆于不同载体，再将重组载体转移到适宜的宿主以建立宏基因组文库，同时结合不同的筛选技术，从基因文库中筛选新基因或新的生物活性物质。这些免培养技术可不通过对微生物进行培养的方法，为人们在一定程度上了解烟叶微生物区系的复杂性，以及微生物与烟叶之间的相互作用，开辟了一条崭新的道路。

因此，从烤烟烟叶中尽可能完整地提取与纯化微生物，对于采用免培养技术研究烤烟烟叶微生物的群落结构组成，揭示在烟叶加工过程中更加丰富、全面的烟叶微生物群落信息，提供有关烟叶微生物种间相互作用关系及其生物功能的新信息，系统地剖析烟叶微生物群落的多样性和动态变化，较全面了解大烟叶微生物群落的代谢机理具有重要意义。同时，对于考察烟叶微生物基因多样性、种群结构与群落复杂性，探索烟叶环境中微生物种群特征，了解烟叶生态系统中微生物群落结构及在烟叶环境中的生存机制亦具有重要科学价值。

经文献检索，未发现与本发明内容相同的公开报道。

发明内容

从烤烟烟叶中富集和纯化微生物，去除非微生物杂质，尽可能完整地保持微生物多样性，是进行烤烟烟叶微生物免培养技术研究的前提。

为实现上述目的，本发明的烤烟烟叶中微生物的富集与纯化方法由以下步骤组成：

(1)用0～1.0％氯化钠，0.01％～0.1％吐温80水溶液浸泡烤烟烟叶并振荡洗涤，控制分散剂与烤烟烟叶的质量比为1∶10～1∶40，振荡洗涤时间为10～30分钟，然后用20～40目分样筛除去烟叶残渣，制备烟叶微生物悬浮液；

(2)上述烟叶微生物悬浮液用孔径为30～120微米的滤布减压过滤，滤饼用分散剂洗涤，得滤液A和滤饼A；

(3)上述滤液A用硅藻土减压预涂层过滤，控制预涂膜厚度1～10mm，每平方米过滤面积预涂500～1000g硅藻土，滤饼用分散剂洗涤，得滤液B和滤饼B；

(4)上述滤液B用孔径为0.2微米的微孔滤膜减压过滤，滤饼用分散剂洗涤，得滤饼C；

(5)合并混匀上述滤饼A、滤饼B和滤饼C，即得富集和纯化的烤烟烟叶微生物。

本发明的方法对烤烟烟叶微生物进行分级过滤富集和多次洗涤纯化，步骤简单，容易操作，富集效率高，适合任何样本容量的烤烟烟叶微生物富集和纯化，特别适用于大容量样本的烤烟烟叶微生物富集和纯化。

附图说明

图1为烟叶微生物悬浮液分别经滤布、硅藻土和微孔滤膜减压过滤和分散剂洗涤后，滤布、硅藻土和微孔滤膜上微生物的滤饼显微镜检图。