[发明专利]一种耐表面活性剂的内切β-1,4-葡聚糖酶基因工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌的构建方法，属于基因工程和酶工程领域。 

背景技术

纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，主要包括三类，分别为内切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。其中，内切β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系中的重要组分，能随机水解纤维素的β-1，4-葡萄糖苷键，产生纤维低聚糖，广泛用于纺织和洗涤等工业。内切β-1，4-葡聚糖酶的产生菌很多，主要有丝状真菌、细菌等。目前研究最多的是木霉(Trichoderma)。 

附着在衣物表面的污垢易被传统洗涤剂清洗，而在衣物间隙中的污垢与衣物粘黏在一起难以洗净，反复洗涤以后，衣物便会发旧泛黄。将内切β-1，4-葡聚糖酶加入洗涤剂中，改变了传统的去污机理，它使棉织物的纤维素结构膨松，利于洗涤剂成分进人纤维间隙与污垢充分接触，从而大大提高了洗涤效果，并且用添加纤维素酶的洗涤剂洗过的衣物，色泽鲜艳、柔软，对衣物损伤小。 

洗涤剂中通常含有大量的表面活性剂，易造成酶蛋白部分或者完全变性失活。因此要求添加到洗涤剂中的纤维素酶对表面活性剂具有一定的耐受力。Andre等从土壤中筛选到Streptomyces drozdowiczii并分离纯化出其中的内切β-1，4-葡聚糖酶，研究了其在商品化洗涤剂环境中的稳定性，室温放置一小时后酶活降低15％左右；Jinichiro等从Staphylotrichum coccosporum中分离纯化出内切β-1，4-葡聚糖酶STCE1，研究发现STCE1是45家族中对表面活性剂耐受力最好的内切酶。 

近年来，随着洗涤工业的发展，洗涤用内切β-1，4-葡聚糖酶的需求量日益增大，因此筛选耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶，并且构建适合大规模发酵生产的基因工程菌显得日趋重要。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因工程菌，是以携带重组质粒表达耐表面活性剂的内切β-1，4-葡聚糖酶基因的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。 

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述基因工程菌的方法，通过克隆内切β-1，4-葡聚糖酶基因cel5A(NCBI编码：3579455)到pET-24a载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现了内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的高效表达。 

所述重组质粒为pUC系列，pET系列，pT7-7，或pGEX中的任意一种。 

本发明提供的重组酶在洗涤剂常用的表面活性剂中稳定性实验，包括如下步骤：重组酶中分别加入终浓度为1mM的几种洗涤剂中常用的表面活性剂，25℃下，保温一小时后测定残留酶活。 

所述的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯九醚、壬基酚聚氧乙烯醚和阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠中任一种。 

附图说明

图1重组内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A摇瓶发酵产酶曲线。 

图2重组内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A蛋白SDS-PAGE图。 

1、发酵液上清；2、破壁上清；3、包涵体；M、标准蛋白分子量。 

图3重组内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A分批补料发酵产酶曲线。 

图4重组内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A分离纯化SDS-PAGE图。 

1、纯化后样品；2、发酵液；M、标准蛋白分子量。 

具体实施方式

实施例1：基因工程菌的构建 

1、根据NCBI上登录的cel5A的基因序列(Genbank号3579455)，以嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)总DNA为模板，采用聚合酶链式反应方法合成内切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A的基因序列，连接到pMD18-Tsimple载体，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为pMD18-T simple-cel5A，将此质粒进行序列测定。结果表明此基因全长1293个核苷酸，和NCBI上登录的cel5A的基因序列完全相同。