[发明专利]小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及小麦耐盐、抗旱WRKY转录因子基因TaWRKY79的克隆及其应用。

背景技术

近年来土壤盐渍化及水资源短缺是制约农业生产的一个全球性问题。盐害与干旱不仅严重影响植物的生长发育，造成作物减产，而且使生态环境日益恶化（Saibo et al., Annals of Botany, 2009, 103 (4):609-623）。因此，提高作物的抗旱和/或耐盐能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。分离克隆耐盐基因，培育耐盐新品种已成为全世界的研究热点之一。小麦是重要的农作物，克隆耐盐、抗旱基因，培育耐盐、抗旱小麦新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

目前利用基因工程技术开展植物耐盐、抗旱方面的研究已取得了较大的的进展。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，可以使转基因植物的抗盐能力提高(Chinnusamy et al., Crop science, 2005, 45:437-448.)。

转录因子在基因表达和环境胁迫响应中起着关键的调控作用。目前，已发现了一些能显著提高植物耐盐能力的转录因子。研究表明，将这些基因转化到植物中，可以明显提高植物的耐盐能力 (Nakashima K., Plant Physiology, 2009, 149: 88–95.)。

WRKY是一个转录因子家族，其成员广泛参与植物的正常生长发育和对各种环境胁迫的响应过程。转基因研究实验表明过表达一些WRKY转录因子基因可提高转基因植株的耐盐和耐旱性。例过表达大豆的GmWRKY54基因可使转基因拟南芥的耐盐和耐旱性提高(Zhou et al., Plant Biotechnology Journal, 2008,6,486-503.)。将大麦的HvWRKY38转入牧草可提高转基因牧草的生物量和耐旱性(Xiong et al., Molecular Breeding, 2010, 25: 419–432.)。AtWRKY25、AtWRKY33过表达拟南芥也增加了对盐胁迫的耐受性。目前有关小麦WRKY转录因子在耐盐方面的研究还非常有限，Niu et al研究表明过表达TaWRKY2和TaWRKY19可提高转基因拟南芥的耐盐和耐旱性(Niu et al., Plant cell and environment, 2012)。进一步克隆小麦耐盐、旱相关基因，通过基因工程培育小麦耐盐、耐旱新品种非常重要。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种首次从小麦中分离出一个耐盐、抗旱的WRKY转录因子基因，命名为TaWRKY79。将该基因连接到过表达载体pCAMBIA super 1300上，利用农杆菌浸染法转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株的生物量、耐盐性、抗旱能力均比未转基因对照植株提高。

本发明的技术方案为：一种小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79，TaWRKY79基因的cDNA序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

   本发明小麦耐盐、抗旱基因TaWRKY79的制备方法：首先根据小麦的基因芯片表达谱数据选出在小麦幼苗根中受盐胁迫显著上调表达的WRKY转录因子基因（探针），然后根据探针序列设计基因特异性引物，进一步从小麦根的全长cDNA文库中克隆其全长cDNA，最后构建过表达载体转化到拟南芥中进行功能研究。

1．引物设计

根据芯片探针序列设计基因特异性的下游引物Wrky1-1:5′-GCTGCATCCACTCTAGAATGTCG-3′，与文库的5′端锚定引物NT3：5’-ACTAAAGggaACAAAAGCTGG AG-3’进行配对，以小麦幼苗根的全长cDNA文库为模板扩增基因的全长cDNA。

2．PCR 反应体系（50μL）及程序

2×GC bufferⅠ          25μl

模板cDNA文库          1ul

dNTPs（10mM each）    1μl

Primer1 (10μM)          1μl

Primer2(10μM)           1μl

LA Taq(TaKaRa)        0.5ul

ddH₂O                 加至终体积50μl