[发明专利]Hib多糖纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种Hib多糖纯化工艺。

背景技术

b型流感嗜血杆菌Hib(Hamephilus influenzae type b，简称Hib)多糖疫苗自1985年在美国上市以来对较大儿童接种以后产生了良好的免疫效果，但对18月龄以下婴幼儿不能诱生有效杀菌抗体，也不能诱发免疫记忆，免疫实际效力很低，阻碍了Hib多糖疫苗的推广使用。而造成这种现象的原因是多糖属T细胞非依赖性抗原，在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，多糖类抗原不能刺激机体产生有效抗体，所以Hib多糖对这一高危人群不能起到有效保护作用。为了改变多糖的非T细胞依赖性，可以将多糖共价偶联到一种蛋白载体上，使之转变为T细胞依赖性抗原。结合疫苗的研制成功很好的解决了2岁以下婴幼儿免疫原性差的问题，已于1987年开始投放市场。在随后几年，三种新的疫苗很快面市，其采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些不同的结合疫苗部在使用过程中被证实具有良好的免疫应答和持久免疫力，保护了接种的小儿。但在国内，因为某些技术上的瓶颈，造成疫苗的产能不多，接种费用比较高，限制了Hib疫苗的扩大免疫计划。

不论是以何种蛋白作为载体的Hib结合疫苗部需要有各项指标符合药典(2010)的三部标准，抗原性好的Hib多糖作为衍生的原料，否则直接影响结合产物的质量。

现在的Hib多糖纯化工艺包括以下步骤：

(1)将已杀菌的培养物离心去菌体后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀收集复合多糖，乙醇沉淀收集粗制多糖，并依次用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物，干燥后即为粗制多糖；

(2)将粗制多糖溶解于1/10饱和醋酸钠溶液中，然后按适当比例用冷酚溶液重复抽提3～5次。收集上清液，脱酚，再加乙醇至最终浓度为60％～80％，离心后收集沉淀物，或超滤浓缩后乙醇沉淀，取上清，然后加入60％～80％的乙醇溶液沉淀多糖，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，所得固体即为精制多糖。

按现有的Hib多糖制备工艺纯化的PRP步骤繁琐，试药、试剂使用量大(对环境的影响也更多)，纯化过程不够温和(对Hib抗原损伤较大)，收率不高，而且最后制备得到的精糖某些指标不合格或是不稳定。从整个生产周期来看，使得生产企业的多糖产能受限。

发明内容

本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种Hib多糖纯化工艺，解决了现有的Hib制备工艺中核酸不易去除，纯化过程繁琐，步骤多，一次性合格率低，批次间稳定性差异大，化学药品使用量大且产生的废弃物(试剂、药品)多，精制回收率偏低等问题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：Hib多糖纯化工艺，它包括以下收集多糖复合物沉淀、离心收集粗糖沉淀、洗涤粗糖沉淀、干燥粗糖、溶解粗糖、酚抽取、除酚、精制精糖八个步骤：

S1：收集多糖复合物沉淀：

S11：将灭菌后的培养液进行离心处理，离心去除菌体，收集上清液；

S12：向收集到的上清液中加入5～15％的十六烷基三甲基溴化铵溶液，直至终浓度为1～3‰，搅拌混合均匀后，于2～8℃下静置4～6小时，然后离心收集多糖复合物沉淀；

S2：离心收集粗糖沉淀：

S21：用适量0.4～1.0M的NaCl解聚多糖复合物，再加入95％乙醇至终浓度为20～30％(v/v)，2～8℃静置12～20h，在3～5℃，4000～4500转/分离心条件下离心40～80分钟，然后去除沉降，收集上清液；

S22：将上清液用0.65～1.2um的膜过滤，滤液用30KD膜超滤浓缩至原体积的1/3～1/2后加乙醇至终浓度为60～80％(v/v)，搅拌混匀后于2～8℃静置12～20h；

S23：在3～5℃，4000～4500转/分离心条件下离心40～80分钟后，弃上清，离心收集粗糖沉淀；

S3：洗涤粗糖沉淀：用预冷乙醇和丙酮洗涤粗糖沉淀，去除多糖中的某些微量杂质；

S4：干燥粗糖：在环境温度低于15℃下真空干燥粗糖10h以上，干燥完成后于-40℃或以下贮存粗糖；

S5：溶解粗糖：向干燥后的粗糖内加入1/10饱和醋酸钠溶液，直至终浓度为5～10mg/ml，于2～8℃下搅拌浸泡12～20h；

S6：酚抽提：按粗糖∶冷酚比为1∶1的比例加入冷酚，充分混匀，在8～12℃，4000～4500转/分的离心条件下离心40～80分钟后收集上层水相；

S7：除酚：用注射用水稀释上清液后用30～50KD膜超滤透析至酚残留量小于0.05％时收集超滤液；