[发明专利]生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用。

背景技术

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是人体必须的氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域。低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)的应用日益广泛，作为合成阿斯巴甜两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外，L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的应用不断扩展，需求量也将不断增加。

传统的菌株选育是从自然界中筛选有产L-苯丙氨酸能力的菌株，并建立其培养条件开始的。但是该方法所能积累的氨基酸种类有限，后来在确立突变技术和阐明氨基酸合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的选育，但是采用常规诱变育种的方法，盲目性大，工作量繁重，不能增加基因的数量，且突变株一般都携带营养缺陷，产量进一步提高受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供生产L-苯丙氨酸的工程菌及其应用。

本发明保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将pheA蛋白的编码基因、aroD蛋白的编码基因、aroE蛋白的编码基因和talA蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述大肠杆菌的CICC编号为10245；所述pheA蛋白如序列表的序列1所示；所述aroD蛋白如序列表的序列3所示；所述aroE蛋白如序列表的序列5所示；所述talA蛋白如序列表的序列7所示。

所述pheA蛋白的编码基因可如序列表的序列2所示；所述aroD蛋白的编码基因可如序列表的序列4所示；所述aroE蛋白的编码基因可如序列表的序列6所示；所述talA蛋白的编码基因可如序列表的序列8所示。

所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述pheA蛋白的编码基因、所述aroD蛋白的编码基因、所述aroE蛋白的编码基因和所述talA蛋白的编码基因。

所述出发载体具体可为载体pBV220。

所述重组质粒具体可为将所述pheA蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的BglII酶切位点、所述aroD蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的EcoRI和BamHI酶切位点之间、所述aroE蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的BamHI和SacI酶切位点之间、所述talA蛋白的编码基因插入所述载体pBV220的SacI酶切位点得到的重组质粒。

所述重组菌为具体可为大肠杆菌(Escherichia coli)MF0018。大肠杆菌(Escherichia coli)MF0018简称大肠杆菌MF0018，已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012051。

以上任一所述重组菌均可用于生产L-苯丙氨酸。

本发明还保护一种生产L-苯丙氨酸的方法，包括如下步骤：将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到L-苯丙氨酸。

所述发酵的条件可为37℃、溶氧50-70％、48小时。所述发酵采用的发酵培养基具体如下：由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下：Na₂HPO₄·12H₂O 20g/L、柠檬酸钠8g/L、谷氨酸钠0.5g/L、酪氨酸0.8g/L、葡萄糖20g/L和氨苄青霉素50mg/L。所述发酵培养基的pH具体可为7。所述发酵过程中通过补加葡萄糖控制发酵体系的葡萄糖含量为4g/L。

所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液的OD_610nm具体可为30。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为1∶4。所述培养的条件可为37℃、溶氧50-70％、12小时。所述种子培养基具体由溶质和水组成；溶质及其在发酵培养基中的浓度如下：蛋白胨1g/100mL、氯化钠1g/100mL、酵母粉0.5g/100mL和氨苄青霉素50μg/mL。所述种子培养基的pH具体可为7。

本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-苯丙氨酸，发酵48小时后，发酵液中的L-苯丙氨酸含量高达75g/L，极具生产应用价值。

附图说明

图1为载体pBV220的结构示意图。

图2为重组质粒pBV220-pheA的结构示意图。