[发明专利]一种组织工程软骨支架材料及其制备方法和装置

权利要求书

1.一种组织工程软骨支架材料，其特征在于，由上至下依次为表层、中层和钙化层；其中表层由冻干软骨基质和II型胶原组成，基质纤维在水平方向平行分布；中层由冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原及TGF-β组成，其基质纤维呈纵向排列；钙化层由冻干软骨基质、GAG和X型胶原及煅烧骨粉组成，钙化层内的纤维在三维空间交错分布。

2.制备权利要求1所述的组织工程软骨支架材料的方法，其特征在于，是将天然软骨基质制备成凝胶，添加GAG、X型胶原及煅烧骨粉后，冻干制备钙化层；将天然软骨基质与GAG、X型胶原、II型胶原及TGF-β混合后，在钙化层表面进行低温定向结晶，经冷冻干燥后形成中层；将天然软骨基质与II型胶原复合后，采用旋转涂层方法在中层表面制备表层，晾干后得到组织工程软骨支架材料。

3.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤一、天然软骨基质的制备：在4℃条件下，将哺乳动物无软骨膜的关节软骨块放入液氮冷冻3小时后，转入预冷的粉碎机中粉碎，采用体积浓度为1％的醋酸溶液溶解，经真空冻干得到软骨基质；

步骤二、钙化层的制备：将冻干软骨基质、GAG和X型胶原溶于体积浓度为1％的醋酸溶液中，使终浓度分别为5～12mg/ml、8～15mg/ml和5～10mg/ml，用氢氧化钙溶液调pH至中性，得到软骨基质溶液；将粒径0.05～0.2mm的煅烧骨粉按0.1～0.5g/ml的量与软骨基质溶液混合均匀，得到凝胶溶液，将其注入培养器皿底盒，使凝胶层厚度为1～4mm，加盖后在37℃条件下待凝胶溶液凝固后，连同器皿一起置入-80℃环境中冷冻，形成钙化层；

步骤三、中层的制备：将冻干软骨基质、GAG、X型胶原和II型胶原溶于体积浓度为1％的醋酸溶液中，使终浓度分别为5～12mg/ml、4～10mg/ml、2～5mg/ml和4～10mg/ml，用氢氧化钙溶液调pH至中性，再加入终浓度为2～15ng/ml的TGF-β，得到支架材料的中层凝胶溶液；将步骤二冷冻的盛有钙化层的培养器皿置于-80℃的底板上，在0～10℃的空气环境中，将中层凝胶溶液注入培养器皿内的钙化层表面，该凝胶层厚度为1～3mm，加盖后待凝胶溶液结冰，转入-80℃环境下冷冻3小时以上；再经低温真空干燥，得到软骨支架材料的中层与钙化层结构；

步骤四、表层的制备：将冻干软骨基质和II型胶原溶于体积浓度为1％的醋酸溶液中，使终浓度分别为1～3mg/ml和9～30mg/ml，用氢氧化钠溶液调pH至中性，采用真空旋转涂膜方法将其均匀涂布于低温真空干燥的中层表面，其旋转速度500～3000rpm，时间20～100s，晾干后得到组织工程软骨支架材料。

4.制备权利要求1所述组织工程软骨支架材料的培养器皿，其特征在于，培养器皿由下至上依次为底盒、增高圈及上盖，其相互之间能够密封扣合；底盒的内径为5～30mm，深度为1～10mm；增高圈深度为1～5mm。