[发明专利]杀菌肽LL-37的基因工程的表达及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及杀菌肽LL-37的基因工程表达方法及其制备方法以及杀菌肽LL-37在皮肤感染中的应用。

背景技术

自1909年奥地利科学家首先报道、1932年德国科学家第一个将合成磺胺类药物百浪多息应用于临床以来，抗菌药物的研发在整个药物研发领域占据重要地位，人类与病原体的斗争一度占据上风。然而随着抗生素的广泛应用，滥用抗生素及伴随而来的细菌的耐药性、抗生素的副作用等问题逐渐成为人类面临的严峻问题。多重耐药菌(multiple drug-resistant，MDR)、极度耐药菌(extensively drug-resistant，XDR)及泛耐药菌(Pan drug-resistant，PDR)的高频率出现，是目前公共卫生面临的重大难题。近期报道的超级细菌指携带新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metal-beta-lactamase 1，NDM-1)的一类细菌，属于XDR或PDR，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)也是较为常见的MDR。

开发新型抗生素的周期很长，传统方法需要10年左右，而细菌针对一种新的抗菌药物产生耐药性的平均周期为2年，抗生素新药研发的脚步已经追不上细菌诡变的脚步。开发具有新型结构、新作用机制、新作用靶点的安全的抗菌药物是公共卫生安全的需要。杀菌肽(antimicrobial peptide，AMP)是一种多肽类抗菌药物，作用机制与目前的抗生素不同，正是目前的一个研究热点。

生物体对外界微生物的入侵本能的反应产生杀菌肽，通过迅速有效的天然免疫从而保护机体不受病菌侵害。杀菌肽通常是由不到50个氨基酸组成的富含赖氨酸和精氨酸的阳离子多肽。30余年来，科学家已从各种生物体内分离出1000多种杀菌肽。杀菌肽杀菌与细菌细胞膜的结合有关，而病原体的细胞膜很难对杀菌肽产生耐药。还可能通过刺激B淋巴细胞及其它免疫细胞，包括细胞迁徙、增殖、产生细胞因子和趋化因子发挥作用。杀菌肽对革兰氏阴性、阳性细菌及厌氧菌有效，包括MDR、XDR及PDR。此外还可杀灭部分病毒、真菌、原虫及寄生虫，又被称为“新型抗生素”。同时由于杀菌肽本身没有毒性，代谢产物为人体本身的氨基酸，已受到国内外广泛关注。

LL-37是目前在人类发现的唯一的内源性生物杀菌肽(cathelicidin)，呈兼性的α-螺旋，由中性粒细胞、巨噬细胞、粘膜上皮细胞和成角质细胞等产生，是中性粒细胞颗粒中的主要成分，在血浆、呼吸道表面分泌的液体和伤口的分泌物中均能检测到LL-37的存在，在血浆中的浓度较低，具有广谱的杀菌作用和免疫调节作用。带有大量正电荷的LL-37与细菌细胞膜结合，破坏细胞壁的完整性；LL-37刺激中性粒细胞、单核细胞和T细胞的趋化作用，对巨噬细胞具有双向调节的作用，一方面与IL-1β协同促进巨噬细胞的炎症反应，另一方面与脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的结合抑制LPS引起的巨噬细胞炎性细胞因子的产生并降低TRL介导的巨噬细胞激活；LL-37还可抑制细菌粘附和生物膜的形成，从而破坏细菌在宿主体内的自我保护而起到杀细菌作用。因为许多院内感染细菌通过吸附作用及其后形成的生物膜对抗宿主的天然免疫，并逃避传统抗生素的杀菌作用，也是细菌产生多重耐药的机制之一。因而LL-37有可能应用于对院内感染的预防和治疗，并可能成为对多重耐药菌的治疗策略的一部分。LL-37临床杀菌效果好，最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)低，无明显的溶血反应，性质稳定，具有广阔的应用天地。

杀菌肽能否通过基因工程量产是其成为临床候选药物广泛应用的关键。LL-37需要量产以满足基础科学研究及临床试验的需要。LL-37目前主要是化学合成。多肽化学合成的每一步，都要去掉其副产物，所以随着氨基酸序列的长度越长，多肽的化学合成越繁杂，HPLC制备副产物越多，价格越昂贵，LL-37由于其兼性的α-螺旋的结构，可能存在空间位阻，化学合成十分困难。目前LL-37化学合成的市场价格高达每毫克一千美元，且生产过程中会产生大量的有机溶剂废液(生产1kgLL-37约1000L有机废液)，不利于环保。而基因工程生产杀菌肽应该是一种能够量产及相对廉价的方法，然而，尚在起步阶段，多国投入巨大资金进行研究。