[发明专利]制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液

说明书

技术领域

本发明属于医药领域中的重组蛋白质药物，涉及制备重组人源神经生长因子蛋白质的方法及复性液。

背景技术

神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一。NGF对正常神经细胞具有营养作用，对损伤神经修复机能具有调节作用，可以维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向，对促进大脑的发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复等具有决定性作用。

人源神经生长因子(hNGF)可应用于神经系统疾病，如糖尿病性周围神经病变、老年痴呆症、帕金森症、面神经炎以及包括脊髓损伤、高位截瘫、断肢再植、脑损伤、周围神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤的神经损伤，hNGF是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人源神经生长因子(rhNGF)成为唯一的选择。

利用基因工程技术、以微生物或酵母为载体生产外源蛋白质具有广阔的应用前景。到目前为止，已经发展了多种蛋白质表达系统。

CN100357441C公开了一种新的表达人源神经生长因子的酵母表达系统：将合成的hNGF基因插入由商购的pPIC9K质粒改造的pPIC9KL质粒，构建表达hNGF的重组表达载体；用该重组表达载体转化酵母宿主，构建表达hNGF的酵母表达系统；最后培养该酵母表达系统，获得hNGF。但该专利中GS115酵母菌株生产NGF的发酵周期为160～180小时，而使用大肠杆菌生产NGF的发酵周期一般为30～35小时，远远短于酵母发酵的周期，生产成本低；同时，酵母的培养要求相比大肠杆菌要高很多，培养成本高。

大肠杆菌表达系统是研究的最清楚的一套原核表达系统，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高、表达产物分离纯化相对简单以及适于工业化生产的优点，其应用非常广泛。CN1219795C公开了一种用二硫键异构酶(PDI)促进变性的重组人源神经生长因子正确折叠并提高其复性率的方法。但是PDI价格昂贵，大大增加了生产成本。

常规的复性制备rhNGF蛋白质的方法使用缓慢加入复性液的复性方法，复性率较低、制备过程复杂、耗时长、操作复杂，因而生产成本较高。

发明内容

本发明针对rhNGF蛋白质在工程大肠杆菌表达系统中包涵体复性率较低、制备过程复杂、耗时长、操作复杂，生产成本较高的问题，提出了能够显著提高复性率、设备要求非常简单、耗时短、操作简单的复性方法。同时提供了一种复性液，该复性液提高了rhNGF蛋白质的复性率，同时降低了生产成本。

本发明的技术方案通过改变复性液的加入速度提高了rhNGF蛋白质的复性率。本发明涉及制备rhNGF蛋白质的方法，该方法包括步骤①通过工程大肠杆菌表达rhNGF蛋白质，②破碎表达rhNGF蛋白质的工程大肠杆菌菌体，③离心收集rhNGF蛋白质的包涵体，④利用变性体系变性溶解所述入到所述包涵体溶解后溶液rhNGF包涵体以形成包涵体溶解后溶液，⑤复性液以大于1080ml/min的流速加入进行复性，⑥纯化rhNGF蛋白质。复性液瞬间稀释复性大大提高了复性率，稀释后可以摇匀或玻璃棒搅匀，降低了对设备的要求，操作简单。

所述方法步骤①中使用的工程大肠杆菌包括各类大肠杆菌表达菌株，优选BL21(DE3)。

所述方法步骤②中可使用各种菌体破碎方法，优选超声破碎。

所述方法步骤④中的变性体系包括尿素变性溶解液和盐酸胍变性溶解液等，优选尿素变性溶解液。

步骤④中，复性液以大于1080ml/min的流速加入到所述包涵体溶解后溶液中，摇匀或玻璃棒搅匀，然后静置，优选4℃静置4小时。

步骤⑤中，使用的复性液包含45～55mM Tris-HCl，0～10mMβ-巯基乙醇，0～1mM二价铜盐，0.95～1.05mM EDTA，pH8.5～10.0。该复性液采用廉价的组分，降低了生产成本。同时使用该复性液可提高复性率。

根据本发明的一个实施方式，所述复性液的pH值为9.0～10.0。优选pH值为9.0。

根据本发明的一个实施方式，所述复性液中β-巯基乙醇的浓度为2.5～5mM，优选5mM。

上述复性液中，可使用各种二价铜盐，如CuSO₄和CuCl₂等。根据本发明的一个实施方式，使用CuSO₄。根据本发明的一个实施方式，所述二价铜盐浓度为10～20μM，优选10μM。