[发明专利]稻瘟病抗性基因Piym2及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Piym2的分离克隆与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要粮食。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的稻谷减产达10%～30%，严重时达30%～50%，甚至颗粒无收。在我国稻瘟病常年发生面积在380万亩左右，造成数亿公斤的稻谷损失，直接威胁着国家的粮食安全。

培育和利用抗病品种一直被公认为最经济有效和环境友好的稻瘟病防治措施。但是，由于稻瘟病菌群体结构复杂，加之其致病性易于发生变异，一些潜在的或新产生的致病小种的迅速繁殖，一个抗病品种往往推广3-5年就发生感病化。广泛挖掘抗病资源，鉴定和克隆抗病基因，培育广谱、持久抗病新品种，是当前水稻抗稻瘟病病育种研究工作的当务之急。

随着分子生物学的快速发展，迄今至少已有70多个水稻抗稻瘟病主效基因被分子定位，分别位于除第3染色体以外的11条水稻染色体上，其中2/3以上位于第6、11和12染色体，且成簇分布。在稻瘟病抗性基因克隆方面，正式报道的已有18个抗性基因，即Pib、Pita、Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik-m、Pik-p、Pi5、Pia、Pit、Pish、pi21、Pb1。除Pid2编码一个丝氨酸/苏氨酸受体类激酶，Pi21编码一个富含脯氨酸的蛋白，各自代表一种新的抗性基因类型外，其余的已克隆的16个基因全都属于NBS-LRR (Nucleotide binding site-Leucine rich repeat) 基因家族。

Pib(Wang et al., 1999) 是第一个被克隆的稻瘟病抗性基因，克隆自日本粳稻品种TohokuIL9，位于水稻第2 染色体的长臂末端。它包含有4个内含子，全长cDNA由1个5'非翻译区(UTR)、1个的开放阅读框（ORF）和1个3'非翻译区等组成。Pib 编码一个由1251 个氨基酸组成的蛋白产物，属于典型的NBS-LRR类抗病基因。环境条件(如温度、光照等)的变化可影响Pib的表达。

Pita (Bryan et al., 2000) 克隆自日本粳稻品种Yashiro-Mochi，位于水稻第12染色体近着丝点区域。它包含2个外显子和1个的内含子，编码一个由928 个氨基酸组成的质膜受体蛋白，包含NBS结构域和富亮氨酸结构域 (LRD)。Pi-ta 抗感位点编码的产物只有一个氨基酸的差异，即918位的丙氨酸变为丝氨酸。Pi-ta介导的抗性可能是Pi-ta蛋白与AVR-Pita蛋白互作的结果，但需要一个与之共分离的单显性基因Ptr(t)的参与(Jia et al., 2008)。

Pi9 (Qu et al., 2006)、Pi2和Piz-t (Zhou et al., 2006) 均位于第6染色体短臂近着丝粒区，都属于NBS-LRR类基因，但它们的2个内含子分别位于NBS区之前和LRR区之后，而不像其他NBS-LRR基因的内含子位于NBS区的激酶2的N端。Pi 2与Pi z-t高度同源，两者仅有八个氨基酸不同，分布在3个保守的LRR结构区内，显示了LRR结构区与基因的小种专化性有关。

Pi-d2 (Chen et al., 2006)和Pi-d3 (Shang et al., 2009) 都克隆自我国籼稻品种地谷。Pi- d2位于第6染色体短臂近着丝粒区，编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白受体激酶，其抗感差异由单碱基突变造成的，即第441氨基酸由异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)。Pi-d3位于第6染色体长臂的近着丝粒区，含有2 个外显子，编码一个由923 氨基酸组成的蛋白，产物含有NBS-LRR结构域和MHD基序。其抗感差异也是因一个单碱基突变造成的，即抗病品种的LRR结构域的第2208位核苷酸处C在感病品种中突变为T，造成编码蛋白的提前终止。