[发明专利]烟粉虱抗真菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟粉虱抗菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与应用。尤其涉及一种重组烟粉虱抗菌肽defensin的纯化制备方法、重组烟粉虱抗菌肽及其抑菌应用。

背景技术

近年来，烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨重的损失例。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，尤其是双生病毒，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。由于烟粉虱寄主范围广，繁殖力强，危害方式多，对杀虫剂产生抗药性的能力特别强，因此，当其入侵到一个新的地区，极易暴发成灾。

由于传统抗菌素的滥用和耐药菌株的不断产生，严重影响了感染性疾病的临床治疗效果。而抗菌肽具有杀菌强，不易引起耐药性等优点，成为抗菌药物新的研究热点。目前抗菌肽产量低，天然抗菌肽的分离难度大，因而倾向于利用基因工程方法获得抗菌肽。

防御素(defensin)是近年来发现的广泛存在于动植物体内的一类阳离子抗菌多肽，由29～54个氨基酸残基组成，含有6～8个保守的半胱氨酸(通常是6个)，分子量小于5KDa。N端有3个β转角和1个γ转角，中间有1个两亲性的α螺旋，C端有1个反向平行的β折叠，由3～4个二硫键连接α螺旋和β转角，形成特定的CSαβ结构。防御素可在特定的细胞中合成并贮存于细胞质的颗粒中，或被病原微生物诱导合成，对多种微生物均具有较强的防御能力，主要作用于病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。

到目前为止，国内外尚没有烟粉虱defensin抗菌肽的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对目前烟粉虱抗菌肽研究状况及其不足，提供一种重组烟粉虱抗菌肽defensin基因和其所编码的抗菌多肽，以及所述基因在基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。

本发明的解决方案是，提供了一种烟粉虱defensin抗菌肽基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。

本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因制备具有抗菌活性的重组蛋白的方法，是通过基因重组技术将所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。

本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因编码的抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述抗菌肽在制备用于防治烟粉虱的药物中的应用，该药物适用的烟粉虱品种为：隐种Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)、隐种Mediterranean(Med)、隐种ZHJ1、隐种ZHJ2或隐种ZHJ3。

相对于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明中的烟粉虱defensin抗菌肽基因原核表达过程中，表达载体中引入蛋白酶Xa因子，能够有效的酶切重组融合蛋白，并根据蛋白分子大小利用超滤方式快速分离得到defensin多肽。整个过程快速简单。

2、本发明中的重组烟粉虱defensin抗菌肽具有抗真菌活性，能明显抑制球孢白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和灰霉菌(Botrytis cinerea)等昆虫病原真菌生长。

附图说明

图1：不同隐种烟粉虱抗菌肽defensin基因PCR扩增产物电泳图。在图1中，M为DNA maker，1-5分别为烟粉虱MEAM1、Med、ZHJ1、ZHJ2和ZHJ3抗菌肽defensin基因PCR扩增产物，bp代表碱基对。

图2：烟粉虱抗菌肽基因和大肠杆菌表达载体质粒pET-32a及defensin成熟肽基因PCR产物酶切图。在图2中，M为DNA maker，1为质粒pET-32a经BamH I和Xho I双酶切后产物，2和3为defensin成熟肽基因PCR产物经BamH I和Xho I双酶切后产物。

图3：烟粉虱抗菌肽defensin成熟肽片段融合表达载体pET32a-Def的构建示意图。