[发明专利]一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌，特别是一种通过代谢工程手段过量表达RoPYC2基因提高胞内丙酮酸羧化酶活性来强化三羧酸循环的回补途径，从而调控碳代谢流从丙酮酸进入三羧酸循环，实现α-酮戊二酸过量积累的酵母工程菌。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称α-KG)是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工和化妆品等行业都有广泛应用。作为三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，α-酮戊二酸参与氨基酸、蛋白质、维生素合成以及能量代谢等重要过程，在微生物细胞碳氮代谢调控中起着重要的作用。

目前，工业上生产α-酮戊二酸主要采用化学合成的方法，但是高污染、使用有毒和有害化学试剂等缺点限制了它的发展空间，而微生物发酵法正以高产量、高生产强度、环境友好等优点受到越来越多的关注。国内外关于微生物发酵法生产α-酮戊二酸的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地解决副产物积累的问题，代谢工程作为一种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然，目前采用代谢工程手段来强化α-酮戊二酸积累的研究鲜有报道，但是鉴于丙酮酸羧化途径在丙酮酸代谢和TCA循环中的重要作用，强化丙酮酸羧化途径应该是一条促进碳代谢流进入TCA循环的有效策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌，其通过过量表达丙酮酸羧化酶基因，强化胞内丙酮酸代谢途径中的重要支路-丙酮酸羧化途径的代谢通量，实现α-酮戊二酸的过量积累。

以下是本发明技术方案的详细描述。

替换质粒上原有的标记基因赋予重组质粒对潮霉素B的抗性

根据NCBI网站上hph基因序列(Genbank：K01193.1)，采用化学全合成方法，获得hph基因序列并克隆到质粒p0(Swennen，D.，M.F.Paul，L.Vernis，J.M.Beckerich，A.Fournier，and C.Gaillardin.2002.Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibody by the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis.Microbiol-Sgm 148：41-50)中，利用hph基因替换质粒p0上原有的URA3标记基因，赋予重组质粒p0(hph)对潮霉素B的抗性，便于后续重组菌的筛选。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明质粒改造成功。

目的基因RoPYC2扩增与表达质粒的构建

根据NCBI网站上Genbank：HM130700.1，采用基因全合成方法获得丙酮酸羧化酶RoPYC2基因，克隆到p0(hph)，得到表达载体p0(hph)-RoPYC2。重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。

过量表达RoPYC2的Y.lipolytica重组菌的筛选

将重组质粒p0(hph)-RoPYC2经AvrII酶切、纯化后，醋酸锂法转化Y.lipolytica WSH-Z06感受态细胞。将能在YPD+HygB平板上生长的菌落，在YPD+HygB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物RoPYC2-F和RoPYC2-R进行PCR验证，得到大约3.5kb的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到Y.lipolytica WSH-Z06(保藏编号CCTCC NO：M207143)基因组中。所得重组菌命名为Y.lipolytica-RoPYC2。该菌在以甘油为唯一碳源的培养基上生长时，丙酮酸羧化酶活性为0.87U/mg protein，是出发菌株的10.2倍。

微生物菌株的种子培养与发酵：

种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，琼脂20g(斜面用)，pH5.5，自来水定容至1L。

发酵培养基(g/L)：甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.2g，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g，盐酸硫胺0.2μg，碳酸钙20g(摇瓶时添加)，自来水定容至1L。

种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。