[发明专利]一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母tsp2-1Δ

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体涉及一株能产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)。 

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一类含铜的蓝色酚氧化酶。漆酶可以氧化一系列芳香族化合物，氧作为电子受体，副产物是水，因此是一种环保型酵素。 

漆酶广泛分布于昆虫、植物、真菌和细菌中。Yoshida首先在漆树中发现了漆酶，一直以来，漆酶受到了科学界的广泛关注，并且在工业生产和环境治理领域得到了广泛的应用。目前，工业上应用的漆酶主要来源于真菌，例如，白腐菌产生的漆酶可用于木质素降解，纺织品漂白和食物处理等，漆酶还可用于环境污染物降解和土壤有机物转化，漆酶在降解木质纤维素产乙醇中也具有潜在的应用价值。真菌漆酶的工业发酵生产存在以下问题：大多数真菌的漆酶表达调控的分子机制不清楚，一些真菌漆酶的表达是组成型的，而另一些真菌漆酶的表达是诱导型的，在真菌的生长过程中漆酶的表达会受到碳源(比如葡萄糖)的抑制，在有些情况下，漆酶会在蛋白酶的作用下失活。 

发明内容

本发明的目的是克服漆酶表达的葡萄糖阻遏抑制问题，提供一株能在高浓度葡萄糖条件下漆酶高产的新菌株。 

本发明提供的能在高浓度葡萄糖条件下漆酶高产的新菌株是一株担子菌属的新型隐球酵母Cryptococcus neoformans(该菌株是野生型菌株JEC21的基因TSP2-1定向敲除突变株，基因TSP2-1的GenBank编号CNJ00820。该菌株于2011年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号CGMCC No.5274，分类命名为新型隐球酵母Cryptococcus neoformans)tsp2-1Δ。 

本发明菌株为国内外首次发现。新型隐球酵母可以产生大量的漆酶，含有2种漆酶基因LAC1和LAC2，LAC1是表达主要的漆酶活性，而LAC2不表达。 

新型隐球酵母的漆酶共价结合到细胞壁上，可以氧化酚底物(去甲肾上腺素等)产生黑色素。影响新型隐球酵母漆酶表达的因素包括：(1)铜离子可以诱导漆酶的表达；(2)高温(37℃)抑制漆酶的活性；(3)葡萄糖抑制漆酶的表达，当葡萄糖耗尽后才起始LAC1的表达。 

本发明经过多年大量的深入研究，培养了一株担子菌，该菌的漆酶表达不受葡萄糖抑制，可在高浓度葡萄糖条件下产生大量漆酶，解决了漆酶生产的葡萄糖阻遏抑制问题。 

本发明通过根癌农杆菌介导的高效转化方法，以新型隐球酵母血清型D菌株JEC21 (MATα)作为野生型菌株，构建了新型隐球酵母的随机突变文库，从中筛选到了漆酶葡萄糖去抑制突变株LZM36。通过反向PCR得到了突变基因TSP2-1(GenBank编号CNJ00820)。通过定向敲除基因TSP2-1获得了漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2-1Δ。通过RT-PCR和漆酶活性测定对菌株tsp2-1Δ的漆酶表达和活性做了详细的分析和检测。 

本发明利用分子生物学方法对漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2-1Δ进行了基因突变鉴定、漆酶表达和漆酶活性分析。 

该菌株可用来在高浓度葡萄糖条件下生产酚氧化酶——漆酶。即在高浓度葡萄糖培养基中培养所述微生物菌株以使所述微生物细胞组成型表达漆酶。 

所述高葡萄糖培养基为2％葡萄糖Asn培养基g/L：天门冬酰胺1g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，pH 5.1，固体培养基则补加20g琼脂粉。 

培养是在需氧条件下，在500mL三角瓶中发酵培养，接种方式采用菌液的接种方式，温度为28-30℃。 

本发明的优点和积极效果： 

本发明提供了一株产漆酶葡萄糖去阻遏担子菌Cryptococcus neoformans tsp2-1Δ。在高浓度葡萄糖(2％)条件下，野生型菌株JEC21的漆酶表达受到抑制，而菌株tsp2-1Δ的漆酶组成型高表达。漆酶活性测定发现菌株tsp2-1Δ是野生型菌株JEC21的9.25倍。本发明解决了漆酶生产的葡萄糖阻遏问题。 

附图说明

图1是本发明提供的菌株tsp2-1Δ的黑色素合成； 

图2是本发明提供的菌株tsp2-1Δ的DNA印迹杂交(Southern Blot)； 

图3是本发明提供的菌株tsp2-1Δ中LAC1的转录表达量。